【关键词】 ，刺激剂
关键词: 刺激剂;成纤维细胞;透明质酸;瘢痕，肥大性
摘 要:目的 了解兔源性透明质酸刺激因子（HASF）对体外单层及三维培养条件下增生性瘢痕成纤维细胞（FB）透明质酸（HA）合成的影响. 方法 从胎兔羊水及血清中提纯HASF分别作用于单层及三维培养的FB细胞，用放免法测定上清液中HA浓度. 结果 在单层培养条件下，随着HASF剂量由0.1mg・L-1 增至0.1g・L-1 ，HA浓度也由（495±37）mg・L-1 增至（914±75）mg・L-1 ，在一定范围内呈剂量依赖性（P&<0.01）.继续增加HASF剂量，HA浓度并不成比例增加，呈显出饱和性.随HASF作用时间由3d延长至7d，HA浓度也呈时间依赖性的增加（P&<0.01）.在三维培养条件下，随HASF剂量的增加，HA浓度也由（90±25）mg・L-1 增至（293±63）mg・L-1 ，也呈剂量依赖性（P&<0.01），且明显低于单层培养条件下HA的浓度（P&<0.01）. 结论 HASF对单层及三维培养的FB有明显的促HA合成作用，并呈剂量和时间依赖性.
Keywords:irritants;fibroblasts;hyaluronic acid;cicatrix，hypertrophic
Abstract:AIM To investigate the effect of hyaluronic acid stimulating factor（HASF）on the hyaluronic acid（HA）syn-thesis of hypertrophic scar-derived fibroblasts cultured three-dimensionally in the monolayer.METHODS HASF，isolat-ed from the fetal rabbit sera and amniotic fluid，was added to the monolayer and three-dimensional fibroblast culture sys-tems.The concentration of HA in the supernatant of the fi-broblast culture systems was measured using radioim┐munoassay.RESULTS Concentration of HA in the mono-layer system increased from（495±37）mg・L-1 to（914±75）mg・L-1 in a dose-dependent manner with the increase of HASF from0.1mg・L-1 to0.1g・L-1 （P&<0.01）.The concentration of HA reached the maximam when HASF at0.1g・L-1 and stopped increasing in proportion to the con-centration of HASF.The concentration of HA increased in a time-dependent manner in the presence of HASF between3rd and7th.In three dimensional culture system，the concentra-tion of HA increased from（90±25）mg・L-1 to（293±63）mg・L-1 in a dose-dependent manner（P&<0.01）.CONCLU┐SION HA synthesis of hypertrophic scar-derived fibroblasts can be stimulated by HASF both in monolayer and three-di-mensional fibroblast culture systems in a dose-and time-de-pendent manner.
0 引言
透明质酸（hyaluronic acid，HA）是影响胚胎伤口无瘢痕愈合的重要因素［1，2］ .羊水中存在的透明质酸刺激因子（hyaluronic acid stimulating factor，HASF）通过刺激伤口部位成纤维细胞而提高伤口部位HA的含量.我们用纯化HASF对增生性瘢痕成纤维细胞生长、增殖及蛋白质合成等［3-6］ 研究的基础上，观察了其对单层及三维培养条件下的增生性瘢痕成纤维细胞（fibroblast，FB）HA合成的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 新西兰兔，体质量3.0kg左右，孕龄20～25d，由第四军医大学实验动物中心提供.3550型自动酶联仪（美国Beckman）SephadexG-25（中国科学院上海脑研究所）、ConA-Sepharose（瑞典Phar-macia）、透明质酸放免测定盒（上海海军医学研究所）.增生性瘢痕组织6（男4，女2）例，供者年龄17～38岁，男4例，女2例.采用组织块法进行成纤维细胞的原代培养.实验采用第4～10代细胞.取孕兔20只，剖腹取羊水，分离胎兔血清，混匀过滤后经Sephadex G-25分子筛层析，用20μmol・L-1 磷酸钠缓冲液作洗脱液，收集第1蛋白峰.再经ConA-Sephrose亲合层析，当第1个蛋白峰流出后，用含0.1mol・L-1 α-D甘露糖酐的同样缓冲液继续洗脱，收集第2个蛋白峰液体即得HASF溶液.比色法测得HASF溶液中蛋白质含量为0.63g・L-1 .
1.2 方法
1.2.1 胶原制备［7］ 女性乳房整形患者3例，年龄18～40岁，取手术切下的正常新鲜皮肤，去表皮及皮下组织，制备真皮组织匀浆，加入5倍量的中性盐提取液（0.05mol・L-1 Tris-HCl，1mmol・L-1 PMSF，1×10mol・L-1 Na-EDTA，0.1mol・L-1 NEM，1mol・L-1 NaCl，pH7.4）4℃搅拌48h，换液1次，抽滤.浸入0.5mol・L-1 冰乙酸中，加入胃蛋白酶（酶:湿重组织为1∶100），24℃搅拌3h，18000g4℃离心2h.沉淀部分可进行二次胃酶消化，上清液中加入NaCl至0.7mol・L-1 ，ph3.7，4℃搅拌24h，18000g4℃离心1h.弃上清，沉淀溶于1m mol・L-1 HCl，反复透析，加入NaCl至终浓度为3.5mol・L-1 ，离心沉淀溶于1mmol・L-1 HCl，反复透析除盐冻干.用1mmol・L-1 HCl，调整胶原浓度为5g・L-1 .
1.2.2 含成纤维细胞的人皮肤胶原网架的制备［10］ 将第4～10代对数生长期细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.5×108 ・L-1 ，按细胞悬液2V（容积）:小牛血清1V∶5×DMEM2V:胶原溶液5V的比例，将上述四种成分快速混匀后加入d33mm培养皿，每皿0.5mL，置入37℃孵箱内10min，形成含成纤维细胞的人皮肤胶原网架，即FPCL（fibroblast-populated collagen lattice，PFCL）.
1.2.3 HASF对单层培养FB细胞HA合成的影响 取24孔板每孔加入FB细胞2.5×104 个，培养6h，弃上清.根据条件培养液的浓度不同，将实验分成5组:HASF0g・L-1 组（对照组），HASF0.1mg・L-1 组，HASF1mg・L-1 组，HASF10mg・L-1 组，HASF0.1g・L-1 组，分别于3，5，7d收集上清液，用放免法测其中HA浓度. 1.2.4 HASF对三维培养FB细胞HA合成的影响 FPCL形成后，按上法分组加入HASF，作用72h后，每皿加入等量胶原酶液消化，用放免法测上清液中HA浓度. 统计学分析:均采用t检测进行分析比较.
2 结果
HASF对单层及三维培养条件下的FB细胞均能刺激其产生HA.在单层培养条件下，随着HASF浓度升高，HA浓度也升高，具有剂量依赖性（Tab1）.当HASF浓度增至0.1g・L-1 ，尽管HA浓度有所增加，但与10mg・L-1 组相比，并无统计学意义，说明HASF刺激FB合成HA也具有饱和性.HA浓度与HASF的作用还存在着时间依赖性，表现为HA浓度随HASF作用时间的延长而增加（Tab2）.在三维培养条件下，FPCL中HA浓度也随HASF浓度升高而增加，呈剂量依赖性（Tab1）.
表1 HASF对FB细胞HA浓度的影响 略
表2 HASF作用不同时间对FB细胞HA浓度的影响 略
3 讨论
HA是组织快速增殖、再生和修复时重要的结构和功能性细胞外基质成份.HASF是创伤后HA合成增加的主要影响者.HASF来源及产生机制不详，目前尚无HASF氨基酸序列报告，也没有其标准品，有关研究多采用Decker介绍的方法提取HASF，并以其体外刺激成纤维细胞产生HA的量来检测所提取HASF的活性.我们发现FB细胞膜上可能存在着HASF的结合位点-受体［8］ .对HASF刺激FB细胞合成HA作用所呈现的剂、时间依赖性及饱和性，我们认为，HASF作为一种蛋白质发挥作用，将与FB细胞膜表面存在的结合位点或受体结合而发挥作用.当HASF被加入FB培养系统后，HFSF就会与细胞膜表面的结合位点结合，促使FB产生HA.随FB细胞结合的HASF数量的增加作用时间的延长，FB产生HA也增加，呈剂量及时间依赖性，当FB细胞的HASF结合位点被饱和时，再升高HASF浓度，因没有更多的HASF结合位点与之结合，因而也不能发挥刺激HA合成的作用，表现为HA浓度达到一定浓度后不再随HASF浓度升高而升高，呈HASF作用的饱和性.
体外三维培养的FB的生物学行为与单层培养的FB有着明显的差别，突出表现在FPCL中FB细胞由于细胞膜表面胶原蛋白受体被饱和而使FB对血清中的各种生长因子的反应性降低，导致FB细胞生长增殖及代谢受到抑制［9］ .在初始接种细胞数相同的条件下，FPCL中各组HA浓度明显低于单层培养组，我们认为也是由于两种培养系统的差异所致.
参考文献
［1］Liu DL.Hyaluronic acid and scarless wound healing ［J］.Chin JClin Reha，2002;6（4）:474-475.
［2］Pajulo OT，Pulkki KJ，Lertola KK.Hyaluronic acid in incision wound fluid:A clinical study with the cell stick device in chil-dren ［J］.Wound Repair Regen，2001;9（3）:200-204
［3］Yang L，Lu KH，Wang Q，Ai YF.The influence of HASF on the growth and proliferation of scar-derived fibroblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（11）:949-950.
［4］Yang L，Lu KH，Wang Q，Ai YF，Wang SC.The influence of HASF on the contraction of scar-derived fibroblasts in3-dimen-sional system ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（11）:946-948.
［5］Wang Q，Lu KH，Yang L，Ai YF，Jiang YP.The influence of hyaluronic acid-stimulating factor on the collagen synthesis of fi-broblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv），1999;20（1）:82-84.
［6］Peng P，Lu KH，Ai YF，Guo SZ.Effect of HASF for external use on ischemic ulcer wound healing of rabbit ears ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（11）:951-953.
［7］Yang L，Lu KH，Wang Q，Ai YF，Wang SC.Three-dimen-sional culture system of hypertrophic scar-derived fibroblasts in human skin collagen Lattice ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（5）:588-589.
［8］Wang Q，Lu KH，Liu GX，Yang L，Jiang YP.Specific sites on surface of FB can bind HASF-are they HASF receptors ［J］.Meiguo Zhonghua Guke Zazhi（US Chin J Ortho），2000;7（1）:52-53.
［9］Han JT，Chen B，Tang CW，Su YJ.Biological characteristics of human skin fibroblasts in different culture conditions ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000:21（10）:36-39.