【关键词】 骨形成蛋白
关键词: 骨形成蛋白;转化生长因子β;骨折愈合;凋亡;原位杂交;原位末端标记法
摘 要:目的 探讨骨折愈合过程中骨形成蛋白2（BMP2），转化生长因子β1（TGFβ1）mRNA的表达与凋亡发生的相关性及意义. 方法 建立颌骨骨折模型，利用原位杂交方法检测骨折愈合的不同时期BMP2和TGFβ1mRNA的表达，同时采用TUNEL法检测细胞凋亡，并进行相关性分析. 结果 ①骨折愈合早期（5～11d）的间充质细胞、成骨细胞和软骨细胞内有BMP2mRNA表达，而TGFβ1mRNA主要在骨折愈合后期（11～14d）的成骨细胞和软骨细胞内表达;②细胞凋亡在骨折愈合的5d和11d最多，以间充质细胞和软骨细胞为主;③BMP2mRNA的表达与凋亡具有正相关（r=0.887，P&<0.01），TGFβ1mRNA的表达与凋亡无相关性（r=0.51，P&>0.05）. 结论 骨折愈合过程伴随凋亡的发生，以控制细胞的数量和清除无用的细胞，BMP2可能直接参与了凋亡发生过程.
Keywords:bone morphogenetic protein;transforming growth factorβ;fracture healing;apoptosis;in situ hybridization;TUNEL
Abstract:AIM To elucidate the correlation of bone mor-phogenetic protein2（BMP2），transforming growth factorβ1（TGFβ1）mRNA expression and apoptosis during fracture healing and its significance.METHODS An experimental model of fracture was established to detect the expression of BMP2，TGFβ1mRNA and apoptosis in the different stages of healing by using in situ hybridization and TUNEL methods.RESULTS ①BMP2mRNA was expressed in mesenchymal cells，osteoblasts and chondrocytes on5～11d whereas TGFβ1mRNA in osteoblasts and chondrocytes on11～14d post-fracture;②the apoptotic cells increased markedly on5d and11d，especially in mesenchymal cells and chondrocytes;and③there was positive correlation between BMP2mRNA expression and apoptosis（r=0.887，P&<0.01）.TGFβ1mR-NA and apoptosis had no correlation（r=0.51，P&>0.05）.CONCLUSION Apoptosis is a normal concomitant of frac-ture healing serving the purposes of controling cell number and eliminating useless cells.BMP2may participate directly in inducing the apoptotic process.
0 引言
骨折修复愈合包含了细胞趋化、聚集、增殖和分化等一系列复杂的组织变化，有许多生长因子参与了这一过程，如BMP，TGFβ，FGF等，它们在胚胎发育的细胞凋亡中也扮演了重要的角色［1，2］ .细胞凋亡是一种主动死亡过程，涉及一系列基因的激活、表达和调控，近年来发现凋亡也参与了创伤修复的全过程［3］ .为了了解生长因子与细胞凋亡的关系，本实验在建立颌骨骨折模型的基础上，利用原位杂交法观察BMP2和TGFβ1mRNA在骨折愈合不同时期的表达，同时利用末端脱氧核苷酸酶TdT介导的dUTP-X切口末端标记（TdT-mediated dUTP-X nick end labeling，TUNEL）法，检测细胞凋亡的发生，探讨BMP2和TGFβ1与凋亡的相关性以及在骨修复中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 pSP65-BMP2质粒由美国遗传研究所Wozney博士惠赠;DIG-DNA labelling and detection kit购自德国Boehringer Mannheim公司;TGFβ1寡核苷酸探针和TUNEL kit购自美国Oncogene Sci-ence公司.家兔骨折模型的建立、标本处理（骨折后1，3，5，7，11，14，21和28d取材）、探针标记及原位杂交等均参照以往方法进行［4］ .正常骨作为对照. 1.2 方法 切片常规脱蜡至水，PBS（0.05mol L-1 ，pH7.5）洗5min，蛋白酶K孵育15min;PBS洗涤后，在30mL L-1 h3 O2 中孵育5min;PBS洗涤后擦干切片周围，加平衡buffer25μL，37℃孵育1min;擦干切片周围，加TdT酶25μL，37℃孵育2h后，加入37℃预热的中止buffer，37℃孵育30min，每10min更换中止buffer1次;显色过程同原位杂交.正常骨作为对照.利用10×10网格，在40×物镜下，每个时间点随机选取5个视野（向同一方向移动切片，不重复，不重叠），分别对BMP2和TGFβ1mRNA及凋亡阳性细胞计数.
统计学处理:采用统计学软件SPSS8.0进行Spearman相关性分析.
2 结果
2.1 原位杂交检测 阳性细胞的胞质呈紫蓝色颗粒.骨折后1d，骨折断端及周围的BMP2和TGFβ1阳性细胞极少;3d，骨折断端骨膜内散在分布的间充质细胞呈BMP2阳性，而TGFβ1阳性细胞仍很少;5d，骨膜内BMP2阳性细胞数明显增加（Fig1），而TGFβ1基本同前;7d，新生骨周围的成骨细胞及未分化间充质细胞呈BMP2强阳性表达，TGFβ1为弱阳性;11d，成骨细胞和软骨细胞内仍呈BMP2的阳性，但强度减弱，而TGFβ1的阳性细胞数和强度增加;14d BMP2的阳性信号强度和数量均明显降低，TGFβ1的阳性细胞数和强度仍较强（Fig2）;21和28d二者阳性细胞数和强度均很低，与正常骨类似.
2.2 凋亡检测 阳性细胞的胞核呈紫蓝色颗粒.骨折后1d，血肿区内见少量凋亡细胞;3d，凋亡细胞增加;5d，骨折部位凋亡细胞明显增多，以间充质细胞为主;7d，在类似于发育的细胞凝聚区内凋亡细胞数增加，而新生骨小梁部位偶见凋亡细胞;11d，软骨区内细胞皱缩，见较多的凋亡细胞（Fig3）;14d，凋亡细胞明显减少，在新骨内可见少量骨细胞呈阳性反应;21和28d，新骨处于改建更新过程，偶见个别成骨细胞发生凋亡，与正常骨接近并趋于一致.BMP2和TGFβ1mRNA及凋亡阳性细胞相关性分析表明，BMP2mRNA的表达与凋亡具有相关性
图1 －图3 略
3 讨论
细胞凋亡是同增殖、分化机制一起共同维持机体内环境稳定的重要因素，它为机体正常细胞的更新和异常细胞的清除提供了手段，特别是许多精细器官的胚胎发生（人胚肢芽、淋巴细胞成熟、神经系统发育等），无一例外地包含着凋亡的机制.若凋亡过程被打乱，最终导致功能障碍或先天畸形.
细胞凋亡是由不同细胞（生长）因子所介导的死亡和生存信号之间的平衡来决定的.在骨基质中包含有多种细胞（生长）因子，它们对成骨细胞的生存和死亡起着重要的调控作用.如IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ，bFGF和胰岛素等促进成骨细胞的存活，而单核细胞因子和TNF-α等加速凋亡的发生.在骨折愈合和骨缺损修复期，这些因子可从骨基质内释放出来共同调节成骨细胞的存活或死亡［7］ .C3H/HeJ系小鼠是一种Fas缺失突变体或Fas配体突变体，通过Fas介导的细胞凋亡缺陷来诱导免疫功能紊乱，将BMP植入该小鼠体内，新骨的形成量与野生鼠相比明显增加，表明凋亡可能在BMP的诱骨作用中发挥重要作用［8］ .TGFβ具有诱导细胞发生凋亡的作用，但有细胞类型特异性，如能够诱导肝细胞、白血病细胞、破骨细胞发生凋亡，但却以剂量和时期依赖的方式抑制胚胎发育期指（趾）间细胞的凋亡，促使其向软骨细胞转化［1，9］ .
表1 BMP2和TGFβ1mRNA及凋亡的阳性细胞计数 略
我们观察到，BMP2和TGFβ1mRNA在骨折愈合的不同时期表达，发挥各自的生物学作用.BMP2在早期骨诱导中发挥作用，TGFβ1促进后期骨质的形成和成熟.在骨折后5和11d，凋亡细胞明显增加.5d为骨折愈合的膜内成骨期，此时骨断端附近的细胞处于去分化状态，增殖明显.在细胞去分化达到高峰时，凋亡细胞也达到最多，提示细胞增生和凋亡这两个过程是协调发生的，而在细胞分化和成熟期，凋亡细胞数量也减少;11d处于软骨形成期，软骨细胞逐渐肥大退化，在这一时期无坏死的发生，而是通过凋亡使得无用的软骨细胞从损伤部位被有序清除，为以后的软骨骨化作准备.本研究表明，BMP2mRNA表达的时间和部位与凋亡的发生相一致，且具有显著正相关，而TGFβ1mRNA的表达与凋亡无相关性， 提示BMP2可能在骨折愈合凋亡的发生过程中发挥一定的作用.
骨折愈合过程中BMP2和TGFβ1mRNA的协同表达可以加速组织的修复，同时伴有细胞凋亡的发生，以控制细胞数量和及时清除失去功能的、无用的细胞，BMP2表达丰富的区域，细胞凋亡的敏感性和发生率增高，BMP2可能直接参与了诱导骨折愈合过程中凋亡的发生，其作用机制有待于进一步研究.
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