关键词: 细胞型朊蛋白;受体，细胞型朊蛋白;细胞粘附分子;小脑颗粒细胞
摘 要:目的 本研究表达了细胞型朊蛋白（PrPc）和碱性磷酸酶（AP）的融合蛋白（PrPAP），并以此融合蛋白作为配体通过结合实验寻找PrPc的受体（或结合蛋白）. 方法 以碱性磷酸酶组织化学法检测表达PrPAP的细胞培养液与细胞表达的细胞粘附分子、少突胶质细胞和雪旺氏细胞系以及原代培养的小脑颗粒细胞的结合，并以含AP的细胞培养液作对照，阳性对照为KitAP及其细胞表面表达受体的结合. 结果 在所表达的细胞粘附分子中，NCAM140有疑似结合，其他L1，CHL1，P0，Tag，F3及PrP未见与朊蛋白的阳性结合;约有20%呈现雪旺氏细胞阳性结合，少突胶质细胞阳性结合率约为60%;原代培养的小脑颗粒细胞与朊蛋白有几乎100%的阳性结合，并且细胞密度高.AP对照仅有微弱染色. 结论 推测朊蛋白的功能作用方式为异嗜性结合;确定原代培养小脑颗粒细胞为进一步分离提纯朊蛋白受体的起始材料，并提示小脑和朊蛋白功能及朊蛋白疾病的可能相关性.
Keywords:cellular prion protein;receptors，cellular prion protein;cell adhesion molecule;cerebellar gra-nule neurons
Abstract:AIM To express，a recombinant protein PrPAP containing the extracellular part of prion protein and alkaline phosphatase（AP）in a secreted form in the culture super-natant.and to use it as a ligand to search for receptors（or binding proteins）for prion protein through binding assay.METHODS AP histochemistry was applied to detect the binding between PrPAP and cell adhesion molecules，cultured oligodendrocytes and Schwann cells;and the primary cul-tured cerebellar granule neurons.The culture supernatant containing AP was used as the negative control.KitAP and its cell surface-expressed receptor was used as the positive control.RESULTS Among the cell adhesion molecules de-tected，only NCAM140showed ambiguous positive binding，the other molecules L1，CHL1，P0，Tag，F3and PrP had no binding with PrPAP.Schwann cell lines showed approxi-mately20%positive binding，the binding rate for oligoden-drocytes was about60%.And the primary cultured cerebel-lar granule neurons had almost100%cells binding with PrPAP.AP controls had only very weak staining.CONCLU┐SION It is concluded that prion protein has a heterophilic binding.Cerebellar granule neurons were selected for the binding material for the further separation of receptors for prion protein.It’s implied that cerebellum might have a close relationship with the physiological functions of prion protein and prion diseases.
0 引言
细胞型朊蛋白（cellular prion protein，PrP）在物种内呈高保守性并且广泛分布于体内各组织，尤以脑组织含量丰富，其生理功能是朊蛋白基础研究的重点，而其中关于PrPc受体的研究成为探究其生理功能的手段之一而备受关注.以往的研究表明PrPc发挥正常功能需要与另一种蛋白（或称之为受体）结合诱导下游事件［1］ .本研究的目的在于通过筛选不同细胞表达的粘附分子、两种髓鞘细胞系和原代培养的小脑颗粒细胞，寻找PrPc的受体或者可以作为进一步分离受体的细胞来源.
1 材料和方法
1.1 材料 ①试剂:Lipofectamine（Life Technolo-gies，Germany），细胞培养液成分（Life Technolo-gies，Germany），PrP抗体（Charles Weissmann博士惠赠），NBT/BCIP（Sigma，Germany）;②细胞:293-EBNA，L929，CHO，COS-1，少突胶质细胞系OLN-93，雪旺氏细胞系S16，（以上细胞由德国汉堡大学分子神经生物研究所提供），表达AP的细胞（Gene Hunter，USA）;③DNA:PrPAP，L1，CHL1，F3，Tag，NCAM（120，140，180），P0，PrP（德国汉堡大学分子神经生物研究所提供）;④动物:C57BL/6J野生型小鼠（德国汉堡大学分子神经生物研究所动物中心提供）.
1.2 方法 ①表达PrPAP和AP:以Lipofec-tamine转染PrPAP质粒至293-EBNA细胞中，48h后，收集细胞培养液，同时培养表达碱性磷酸酶（AP）的细胞并收集培养液，以ELISA法检测PrP和AP活性;②粘附分子的表达:同样以Lipofectamine分别将L1，CHL1转染到L929细胞中，F3，Tag转染到CHO细胞中，NCAM（120，140，180），P0，PrP至COS-1细胞中，并且以略去相应DNA的模拟转染细胞作为对照;③细胞系的培养:少突胶质细胞系OLN-93以DMEM，100mL・L-1 FCS，5×103 U・L-1 青霉素和50mg・L-1 链霉素培养液37℃，50mol・L1 CO2 孵育箱内培养至细胞80%铺满.雪旺氏细胞系S16以DMEM，100mL・L-1 FCS，50mg・L-1 庆大霉素培养液37℃，50mol・L-1 CO2 孵育箱内培养至细胞80%铺满;④原代小脑颗粒细胞培养:小脑颗粒细胞培养自6～8d的C57BL/6J野生型小鼠小脑，方法依据文献［2］，细胞重悬和培养于无血清培养液加1g・L-1 BSA，2.2g・L-1 NaH-CO3 ，100mg・L-1 Na2 CO3 ，27IU・L-1 抑肽酶，5IU・L-1 青霉素，50mg・L-1 链霉素;⑤粘附分子、细胞系及原代培养细胞和PrPAP的结合实验方法参照文献［3］.将细胞和含PrPAP的细胞培养液室温孵育75min，以含AP的细胞培养液作为对照，然后依次进行洗涤、固定、内源性磷酸酶灭活及以NBT/BCIP为底物的碱性磷酸酶的组织化学反应.阳性对照为KitAP及其细胞表面表达受体的结合［4］ .
2 结果
2.1 对所表达的PrPAP的检测 经PrP抗体和以NBT/BCIP为底物的对AP活性的ELISA反应，表明所收集的转染细胞培养液含有所需浓度的PrPAP，可用于细胞结合实验.
2.2 粘附分子和朊蛋白结合 仅表达NCAM140的细胞与PrPAP有类似阳性的结合，但经过重复实验，仍不能非常确定，为结论的稳妥性，定为阴性.其它分子未见有阳性结合.
2.3 细胞系结合实验 结果表明在雪旺氏细胞中，有部分细胞显示阳性结合，估计阳性率约20%（Fig 1），而少突胶质细胞与朊蛋白呈阳性结合的细胞在整个平皿中约占60%（Fig2），而以表达AP的培养液所作的对照，仅有个别细胞类似阳性染色（Fig3）. 2.4 小脑颗粒细胞的结合实验 结果表明该培养细胞与朊蛋白有非常好的结合，有接近100%的阳性率（Fig4），在高倍镜下可见阳性染色的细节，多数染色位于细胞表面和突起，也有少数在胞质（Fig5），而AP对照染色比率非常小（Fig6）. 转贴于 3 讨论
人们用不同的方法分离出不同的细胞型朊蛋白（PrPc）的受体，其中有细胞伴侣蛋白HSP60，Bip，抗凋亡蛋白Bcl-2，板蛋白受体等［5］ .我们的目的在于寻找朊蛋白的结合分子或者发现具有丰富受体源的细胞，从而进行下一步的分离纯化和功能实验.最直接的方法是检测一些已知具有相似特性的分子与朊蛋白的结合潜力.有研究表明PrP具有粘附分子的特性，而已知的各粘附分子之间有相互结合的倾向.对不同细胞粘附分子的结合实验表明这些分子不是朊蛋白的直接结合分子，除了在对NCAM的结合实验中，NCAM140出现很类似阳性的反应，但当时只是疑似，虽经重复实验，仍不能确定.但最近有一篇关于NCAM可能是PrPc受体之一的报道，而且NCAM140是结合的主要成分［6］ .朊蛋白不与自身分子结合，表明它的作用方式是异嗜性的.
选择少突胶质和雪旺氏细胞系作为受体来源的筛选是因为:①细胞系易于培养，只需复苏和传代即可;②在同时进行的细胞组分分析的实验中，发现在分离的髓鞘组分中朊蛋白含量丰富，则推测在髓鞘细胞系中可能有受体存在.朊蛋白是否通过与受体的结合与髓鞘正常功能相关，不能仅由此作出结论，但已有朊蛋白疾病时髓鞘异常的报道［7，8］ .而选择小脑颗粒细胞作为受体源的筛选，是因为在两系出现表现异常的Prnp基因敲除小鼠中，症状皆为晚期的小脑共济失调，而转入Prnp基因后症状得到改善［9，10］ .而且小脑颗粒细胞培养所得的细胞类型均一，产量高.朊蛋白的消长对小脑正常功能产生影响，提示小脑的受累可能因为朊蛋白的敲除而使其受体水平随之下调，或者由于失去配体产生的毒性作用，而正常时该受体与朊蛋白的结合维持着小脑的正常功能.从结合实验的结果可以看出，小脑颗粒细胞与朊蛋白有很高的结合阳性.至此，我们可以确定以原代培养小脑颗粒细胞作为分离提纯细胞型朊蛋白的受体或其复合物的材料，进行更进一步的结合亲和性分析和可能诱导功能的探讨.
图1 －图6 略
致 谢: 本文工作在德国汉堡大学分子神经生物研究中心的Melitta Schachner教授的实验室里完成，并得到她的支持和指导.
参考文献
［1］Vey M，Pilkuhn S，Wille H，Nixon R，DeArmond SJ，Smart EJ，Anderson RG，Taraboulos A，Prusiner SB.Subcellular colocalization of the cellular and scrapie prion proteins in caveo-lae-like membranous domains ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93（25）:14945-14949.
［2］Keilhauer G，Faissner A，Schachner M.Differential inhibition of neurone-neurone，neurone-astrocyte and astrocyte-astrocyte adhesion by L1，L2and N-CAM antibodies ［J］.Nature，1985;316（6030）:728-730.
［3］Cheng HJ，Flanagan JG.Identification and cloning of ELF-1，a developmentally expressed ligand for the Mek4and Sek receptor tyrosine kinases ［J］.Cell，1994;79（1）:157-168.
［4］Flanagan JG，Leder P.The kit ligand:A cell surface molecule altered in steel mutant fibroblasts ［J］.Cell，1990;63（1）:185-194.
［5］Martins VR，Mercadante AF，Cabral AL，Freitas AR，Castro RM.Insights into the physiological function of cellular prion protein review ［J］.Braz J Med Biol Res，2001;34（5）:585-595.
［6］Schmitt-Ulms G，Legname G，Baldwin MA，Ball HL，Bradon N，Bosque PJ，Crossin KL，Edelman GM，DeArmond SJ，Co-hen FE，Prusiner SB.Binding of neural cell adhesion molecules（N-CAMs）to the cellular prion protein ［J］.J Mol Biol，2001;314（5）:1209-1225.
［7］Liberski PP，Yanagihara R，Gibbs CJ Jr，Gajdusek DC.Mecha-nism of the damage to myelinated axons in experimental Creutzfeldt-Jakob disease in mice:An ultrastructural study ［J］.Eur J Epidemiol，1991;7（5）:545-550.
［8］Obermaier G，Kretzschmar HA，Hafner A，Heubeck D，Dahme E.Spongiform central nervous system myelinopathy in African dwarf goats ［J］.J Comp Pathol，1995;113（4）:357-372.
［9］Moore RC，Lee IY，Silverman GL，Harrison PM，Strome R，Heinrich C，Karunaratne A，Pasternak SH，Chishti MA，Liang Y，Mastrangelo P，Wang K，Smit AF，Katamine S，Carlson GA，Cohen FE，Prusiner SB，Melton DW，Tremblay P，Hood LE，Westaway D.Ataxia in prion protein（PrP）-deficient mice is associated with upregulation of the novel PrP-like protein dop-pel ［J］.J Mol Biol，1999;292（4）:797-817.
［10］Sakaguchi S，Katamine S，Nishida N，Moriuchi R，Shigematsu K，Sugimoto T，Nakatani A，Kataoka Y，Houtani T，Shirabe S，Okada H，Hasegawa S，Miyamoto T，Noda T.Loss of cere-bellar Purkinje cells in aged mice homozygous for a disrupted PrP gene ［J］.Nature，1996;380（6574）:528-531.