作者：王新 张宗友 时永全 兰梅 马征 金建平 樊代明
【关键词】 番泻叶
关键词: 番泻叶;小鼠;结肠;蛋白质;双向聚丙烯酰胺凝胶电泳;银染
摘 要:目的 建立和优化蛋白质分子差异展示的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，初步观察番泻叶提取物诱导小鼠结肠组织中蛋白质的差异表达，为进一步筛选其中介导番泻叶生物作用的蛋白质分子奠定基础. 方法 应用番泻叶提取物灌胃制备小鼠慢性胃肠运动增强模型，提取其结肠组织中总蛋白质，优化蛋白质分子差异展示的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，并用其分析模型动物结肠组织中蛋白质，双向电泳凝胶银染法显示其蛋白质的差异表达. 结果 建立了小鼠慢性胃肠运动增强模型，优化了双向聚丙烯酰胺凝胶电技术并用其展示出模型动物结肠组织中有差异蛋白质的表达. 结论 番泻叶提取物可以诱导小鼠结肠组织中蛋白质差异表达，这些差异蛋白质可能介导了番泻叶的生物作用.
sional（2-D）polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）for investigating the different expression of colonic proteins in BALB/c mice induced by extract of senna，and to lay the foundation for screening and characterization of biological molecules mediating the effect of senna from the gastroin-testinal tract.METHODS The model of chronic gastroin-testinal motility hyperfunction in mice was established by in-tragastric administration of senna extraction.The proteins of colon was extracted from control and model mice.The2-D PAGE was optimized for analyzing the different expression of proteins.The2-D PAGE gels were stained with silver stain┐ing.RESULTS An animal model of chronic gastrointestinal motility hyperfunction was established in mice.Optimized2-D PAGE displayed the different expressional proteins in gas-trointestinal tract of model mice.CONCLUSION The dif-ferent expression of colonic proteins can be induced by extract of senna in BALB/c mice.These proteins maybe mediate the effect of senna in gastrointestinal tract.
0 引言
胃肠运动障碍是目前消化系统中最常见的疾病之一，研制新型的胃肠动力药物也是当今的热点.番泻叶是具有促进胃肠运动作用的传统中药，由于它的化学成分复杂，目前对其作用机制尚不清楚.我们通过建立小鼠胃肠运动增强模型，用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术观察其结肠组织中蛋白质的差异表达，研究番泻叶致泻和促进胃肠运动作用的分子机制，筛选和鉴定胃肠道组织中介导番泻叶作用的蛋白质分子，为研制新型的胃肠动力药物奠定基础.
1 材料和方法
1.1 材料 印度进口番泻叶购自陕西省药材公司，经第四军医大学药物研究所鉴定为狭叶番泻叶，番泻叶提取物由第四军医大学药局制备，番泻叶经蒸馏水洗后，100℃煮沸10min，过滤后的沉渣再加水煮沸10min，收集滤液于70～80℃减压浓缩成流浸膏，浓度为1kg L-1 生药，封装于高压消毒的玻璃瓶中，-20℃冻存备用.丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，SDS，三（羟甲基）氨基甲烷，苯甲基磺酰氟均购自华美生物工程公司，超纯尿素购自上海生物工程公司，两性电解质pH3.5～10，pH6～8购自上海丽珠东风技术有限公司，GF-1高速组织分散器为江苏麒麟医用仪器厂生产.DYY-Ⅲ26型双向电泳槽和梯度混合器为六一厂生产，电泳仪为Bio-Rad公司生产.
1.2 方法
1.2.1 慢性胃肠运动增强模型的建立 BALB/c小鼠40只，8wk龄，购自本校实验动物中心，雌雄兼有，18～21g，二级动物，自由进食水.初始随机分模型组25只，对照组15只.小鼠灌胃番泻叶提取物0.05mL，1次 d-1 ，小鼠均可见明显腹泻，水样便和稀粪，2～3d后见小鼠腹泻症状减轻即增加剂量和灌胃次数，至6wk时灌胃0.5～0.8mL，3次 d-1 ，小鼠均腹泻不止，明显消瘦，而对照组则灌以蒸馏水，次数和液体体积与模型组相同.
1.2.2 小鼠结肠组织蛋白质的提取 实验前12h禁食，不禁水.于灌药后3h，3wk，4wk和6wk时随机处死模型组和对照组动物各4～6和3～4只，迅速剖腹取其结肠，于冰盐水（含0.1mmol L-1 PMSF）中清洗干净.立即液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存，此过程均在9min之内完成.配制组织裂解液，参照文献［1］，尿素9.5mol L
-1 ，20g L-1 NP-40，20g L-1 2-ME，20g L-1 pH3.5～10的两性电解质，1.5mmol L-1 MPSF，去离子水配制，（分装后-70℃冻存），称量小鼠结肠组织，按每份组织加5份组织裂解液（m/V）的比例加入裂解液，于冰水中制备组织匀浆，3500r min-1 ，5s×5，然后加DNA和RNA酶，终质量浓度各为0.4g L-1 ，在冰上孵育10min后，以10000g，10min离心，取上清分装贮存于-70℃，同时用Bradford法测定提取液中蛋白质浓度［2］ .
1.2.3 蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用O’Farrell［3］ 系统，第一向等电聚焦在内径0.1～0.2cm，长20cm玻璃管中进行，凝胶由8.25g尿素，2mL300g L-1 丙烯酰胺/18g L-1 甲叉双丙烯酰胺，6mL去离子水，0.75mL两性电解质（pH3.5～10，pH6～8，或pH4～6），0.3mL NP-40，TEMED10μL，和100g L-1 过硫酸胺70μL组成，灌入凝胶玻璃管后室温聚合2h，阴极（上槽）缓冲液为0.02mol L-1 的NaOH溶液，阳极（下槽）为0.85g L-1 的磷酸，200V恒压预聚焦1h后，阴极端上样蛋白质样品，然后800V恒流聚焦，15～20℃，16h，13000Vh，终止电泳后取出凝胶条冻存于-70℃或直接进 行第二向SDS-PAGE.第二向SDS-PAGE配制20cm×20cm×（0.1～0.2）cm的凝胶，分离胶为梯度或均一胶，有或无积层胶，凝胶室温聚合2h以上.第一向凝胶条温度复温后，于平衡缓冲液（0.123mol L-1 Tris，100mL L-1 甘油，20g L-1 SDS，7mmol L-1 DTT，pH6.8）中平衡3～5min，然后固定于第二向凝胶上，于恒流（15～20mA/胶）8～12h，10～20℃进行电泳.凝胶的银盐染色参见文献［4］进行.
2 结果
2.1 正常小鼠结肠组织蛋白质双向电泳 蛋白质第一向等电聚焦pH梯度pH3.5～10，上样量172μg，第二向SDS-PAGE采用20cm×20cm×0.1cm，8%～18%梯度分离胶，积层胶2cm，结果为银染（Fig1）.第一向等电聚焦pH梯度6～8，第二向20cm×20cm×0.1cm，上样量250μg蛋白样品，12%～14%梯度分离胶，结果为银盐染色（Fig2）.
图1 －图2 略
2.2 胃肠运动增强小鼠结肠组织中蛋白质差异表达 正常小鼠结肠组织蛋白质第一向等电聚焦pH梯度为6～8，上样量150μg蛋白质，第二向12%～14%的梯度胶，凝胶银染（Fig3）.模型小鼠结肠组织蛋白质第一向等电聚焦pH梯度6～8，上样量150μg蛋白质，第二向为12%～14%梯度胶，凝胶银染（Fig4）.
3 讨论
我们制备的番泻叶提取物可明显促进小鼠腹泻，胃内灌药后约1.5～2h开始出现腹泻，持续5～6h渐止.通过胃肠推进运动试验和胃肠运动X线分析显示其亦能促进小鼠小肠和结肠的运动，且以后者明显.因此我们通过小剂量灌胃，逐渐增加剂量及日灌胃次数，以使小鼠肠道运动一直处于增强状态，促使小鼠肠道组织中介导番泻叶促肠道运动和粘膜分泌作用的生物分子充分表达，特别是其作用的蛋白质分子充分表达，以便于后续的分离及分析.同时，从小剂量药物开始，可使小鼠产生部分耐受，以便增大药物剂量和造模型的时间而不致小鼠死亡.我们通过仔细模索，初次剂量0.05mL 只-1 灌胃比较合适，6wk时灌胃0.5～0.8mL，3～4次 d-1 ，小鼠全日均腹泻，明显消瘦，衰竭，遂处死.其中在模型3wk和4wk时也分别处死部分小鼠，以便观察模型不同时间肠组织蛋白的差异表达.
蛋白质样品的准备是双向电泳中的关键环节［5］ .从组织中提取蛋白质影响因素很多，无论怎样，整个提取过程中尽可能多地使组织中的蛋白质溶解于裂解液中，尤其是低丰度蛋白，尽量减少提取过程中蛋白质的降解和丢失，其次是保证样品蛋白质不被修饰，否则其等电点将会改变.我们试用了多种组织裂解液，选用了一种效果较好的裂解方法，内含高浓度尿素，较温和的阴离子去污剂NP-40，两性电解质pH3.5～10，以及蛋白酶抑制剂EDTA，PMSF和还原 剂β-巯基乙醇.处理过程均在较低温度下进行，并加了核酸酶以去除核酸对凝胶银染的影响.
O’Farrell双向电泳系统虽有许多不足［6-8］ ，如pH梯度建立不稳定，易随电泳条件、试剂质量的变化而出现聚焦不完全，阴极漂移等，从而使其重复性和稳定性较差.但我们通过反复的实践和摸索，对第一向等电聚焦所用的两性电解质（pH3.5～10，pH6～8，pH4～6），凝胶的直径（0.1cm，0.15cm和0.2cm）和长度（11～16cm），等电聚焦的电压，时间和温度选择及聚焦完全的指标，平衡转移条件，第二向凝胶的梯度及上样量进行了实验分析，选择了pH6～8两性电解质建立了第一向等电聚焦的梯度，凝胶条直径0.1或0.15cm，长15～16cm比较合适，平衡3～5min即可.第二向凝胶梯度12%～14%比较合适（Fig1，2），采用恒流进行SDS-PAGE，上样量150μg左右取得了较满意的结果（Fig3，4），而增加上样量（200μg以上，），较多的蛋白点会重叠（Fig2），增加核酸酶则会减少凝胶银染时的背景和条纹.凝胶上蛋白质的银盐染色是一种高灵敏度的染色方法，可检测出凝胶上0.1～-0.2ng蛋白质样品，比普通考马斯亮蓝染色法灵敏度高50～100倍，虽然放射自显影方法更为敏感，但方法复杂且有放射性污染的危险，因此目前国内外双向电泳凝胶多用银盐染色.我们试用了多种银染方法，结果显示郭尧君修改的银染程序稳定，结果较满意.
我们应用优化的双向电泳条件比较了胃肠运动增强模型小鼠和正常对照小鼠结肠组织中蛋白质表达的差异，这两组比较的过程从样品的制备，上样量到双向电泳至凝胶银染的全过程条件均一样，从它们的双向电泳图谱中也可看出（Fig3，4），许多蛋白质在位置，形态、大小和染色程度上是一致的，因而它们具有可比性.经初步图像分析显示在模型动物结肠组织中有较多的差异蛋白，主要是在蛋白表达量上增加或减少，个别新增加的蛋白点是药物诱导的新的蛋白质或因正常对照组中因量微而未显示出来，则需进一步验证.如图所示的差异蛋白点多在Mr 43000以下，为一些中低相对分子质量蛋白质，而这些Mr 大小的蛋白质分子较多可能是调节蛋白.因此，它们很可能是番泻叶提取物诱导或作用的分子，至于它们介导了番泻叶的何种药理作用尚待进一步研究.
双向电泳技术作为当今蛋白质组分析的核心技术已广泛用于细胞或组织蛋白质的展示，其分辨率很高，双向电泳图谱上每一个点即为一种蛋白质.目前应用的双向电泳方法在一个二维胶上可分辨细胞或组织中成千上万种蛋白质，虽然我们所展示的蛋白点仅有数百个，但用作比较时已能显示出某些蛋白质表达的差异.当然，如能展示出组织中更多的蛋白质，则可能会发现更多的差异蛋白，为排除个体间结肠组织中蛋白质表达的差异，我们对同一组多个小鼠结肠组织蛋白质进行了筛选，因此我们所找到的这些差异蛋白点很可能介导了番泻叶提取物促进小鼠胃肠运动和腹泻的作用，获取这些蛋白质结构和功能方面的信息将是我们下一步研究的目标.
参考文献:
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