作者：鲍岚 张平 程希平 张旭
【关键词】 心脏
关键词: 心脏;大鼠;Y1 受体;神经肽Y
摘 要:目的 为在细胞水平精确地确定神经肽Y（NPY）的Y1 受体样免疫反应物质（-LI）在大鼠心脏中的分布. 方法 用免疫组织化学方法对Y1 受体-LI细胞进行了检测. 结果 ①一些心肌细胞含有Y1 受体-LI，可见清晰的Y1 受体免疫反应性（-Ir）条纹，此类细胞在心脏呈斑点状分布，接近外膜侧和室间隔的内膜侧分布较多，Y1 受体-LI主要分布于心肌细胞膜、横小管膜和小泡上;②心脏内有Y1 受体-LI的心内神经元，此类细胞有较长的突起，呈离散分布，与Y1 受体-LI心肌细胞或血管相邻，Y1 受体-LI神经元的外膜和胞质内有较强的Y
1 受体-LI，尤以其突起明显. 结论 NPY对心脏作用的复杂性可能与Y1 受体在心脏中多种细胞的广泛分布有关.
Keywords:heart;rats;Y1 receptor;neuropeptide YAbstract:AIM To accurately localize neuropeptide Y（NPY）Y1 receptor（-R）-like immunoreactivity（-LI）in rat hearts.METHODS Y1 -R immunoreactive（-Ir）cells were examined with immunohistochemistry.RESULTS Y 1 -R-LI was observed in some cardiomyocytes of rat hearts with a stripe-like pattern in the cells.These cells were scattered in the heart，especially near the outer membrane of the heart and the inner membrane of interventricular septum.Y1 -R-LI was mainly distributed over the plasmalemma of the cell and T tube，and small vesicles.On the other hand，there were dispersed Y1 -R-Ir intrinsic neurons with long processes in the heart，sometimes close to myocardial cells or blood vessels.High level of Y
1 -R-LI was observed near the plasmalemma and the cytoplasm of neurons，especially in their processes.CONCLUSION The complicated effects of NPY on the heart may be related to the extensive distribution of Y1 recep-tor in varied cells of the heart.
0 引言
含神经肽Y（NPY）的神经纤维分布于整个心脏［1］ .通常情况下，NPY与去甲肾上腺素（NA）共存于交感神经元，但大鼠心脏中约有半数的NPY神经纤维不与NA共存，而存在于心内神经元中［2］ .根据药理学实验研究，NPY对心脏的作用至少通过两种以上的受体介导，即Y1 ，Y2 和Y3 等受体［3］ .通过受体放射自显影方法观察到心脏有Y1 受体的结合点［4］ ，用分子原位杂交方法也观察到人类心脏中有表达Y1 受体的mRNA［5］ .但由于已往的检测方法对组织定位的精确性不够，无法在细胞水平精确地确定受体的位置.本研究用针对Y1 受体C末端肽片段的一种纯化的抗血清［6，7］ ，用免疫组织化学方法研究大鼠心肌细胞和心内神经元Y1 受体的分布.
1 材料和方法
1.1 免疫光镜组织化学方法 SD大鼠（体质量200～250g）10只（本校实验动物中心提供），戊巴比妥钠（50mg・kg-1 ，ip）麻醉，经心脏灌注37℃生理盐水50mL和含40g・L-1 多聚甲醛的0.1mol・L -1 磷酸缓冲液（PB）50mL，再灌注4℃同样固定液250mL，取心脏，放入4℃同样固定液后固定1.5h，200g・L-1 蔗糖浸泡24h以上，用冰冻切片机（Leica，德国）切20μm的心脏矢状和冠状切片.根据免疫组织化学方法，将切片放入针对Y
1 受体C末端肽片段的一种纯化的兔抗血清（1∶8000）［6-8］ 中，用生物素标记的羊抗兔血清（1∶200）和Vector ABC盒（Vector实验室，美国）孵育，用葡萄糖氧化酶、二甲基联苯胺（DAB）和硫酸镍胺加强法显色，标记物质呈深蓝色，经干燥、透明和DPX封片.在Nikon Microphot-FX显微镜下观察标本，Leica图像处理系统（Leica-Q570C，德国）取像，出照片.
1.2 免疫电镜组织化学方法 SD大鼠4只，麻醉、灌注和后固定同上，固定液为含50mL・L -1 戊二醛和40g・L -1 多聚甲醛的PB.取心脏，切50～100μm振动切片.免疫组织化学方法处理同上，进行常规DAB反应，标记物质呈棕色.在10g・L-1 锇酸中处理30min，经梯度乙醇和环氧丙烷脱水后，在Epon812中浸润，做平板包埋，聚合后在光镜下定位，取材，在LKBⅢ超薄切片机上切片，不做铅铀染色，在JEOL-1200电子显微镜下观察，拍照，出照片.
用制备抗体用的合成的Y1 受体C末端多肽片段以1μmol・L-1 与Y1 受体抗体预吸收24h（4℃）后，做以上免疫组织化学反应，以此检验抗血清免疫标记的特异性.
2 结果
2.1 心肌细胞 大鼠心脏内一些心肌细胞可见中等强度的蓝黑色着色，为Y1 受体-LI（Fig1），可见清晰的Y1 受体-Ir标记条纹，为心肌细胞内横小管结构，有的与心脏内Y 受体-LI血管相邻（Fig2）.左右心房、左右心室、房间隔、室间隔和房室瓣膜上均有Y1 标记-Ir心肌细胞，此类细胞在心脏呈散在的不均匀分布，近心外膜侧分布较多（Fig3），尤以左心室最明显，室间隔近心内膜的两侧分布也较多.在电镜下可以观察到一些心肌细胞的外膜上有精细和间断的Y1 受体-LI标记，近胞质处有颗粒样的Y1 受体-LI标记物，也可见正在内吞的有Y1 受体-LI标记的小泡（Fig4）.在横小管两侧膜上有Y1 受体-LI标记（Fig5），常在相邻的数个横小管中同时出现，也可间隔出现.
2.2 神经元 大鼠心脏内有较强标记的Y1 受体-Ir神经元（Fig6，7），这些神经元体积小，并有多个突起，有的突起较长，此类细胞在心脏内呈离散分布，单个存在，常与Y1 受体-Ir心肌细胞相邻（Fig6）.左右心房、左右心室、房间隔和室间隔上均有此类Y1 受体-Ir神经元，但在窦房结和房室结周围未见大量的Y1 受体-Ir神经元.心内神经元胞体的外膜有较深的点状Y1 受体-LI标记，其突起的外膜处也有断续的 Y1 受体-LI标记，较胞体外膜多（Fig8）.胞体的胞质内有一些与Y1 受体-LI标记的外膜相临的Y1 受体-Ir小泡，也有一些颗粒状和块状的Y1 受体-LI，神经元的胞核在胞体中占较大部分，有时在胞膜和胞核间的狭小空间内充满了Y1 受体-Ir结构.突起的胞质内有较强的Y1 受体-Ir结构，有时充满了一小段突起，有许多Y1 受体-Ir小泡，另有一些颗粒状结构.这些含Y1 受体-LI的心内神经元可以与周围的心肌细胞相临，在心肌细胞与之相临面可见外膜有Y1 受体-LI（Fig8）;Y1 受体-LI的心内神经元也可与心内血管相临，有时与血管腔只有一层内皮细胞之隔（Fig9）.
用经预吸收后的抗血清孵育组织切片，并做免疫组织化学反应后未见有以上描述的阳性结构.
3 讨论
NPY受体与心脏的变时和变力作用有关［9］ .我们提供了Y1 受体存在于心肌细胞和心内神经元的直接形态学证据.在通常情况下，Y1 受体-LI心肌细胞和心内神经元呈散在的不均匀分布，靠心肌外膜侧较多，左右心房、左右心室、房间隔、室间隔和房室瓣膜上均有分布.Y1 受体在心脏的多种细胞和广泛分布为NPY对大鼠心脏变时和变力作用的多样性［9］ 提供了一定的依据.
图1 －图9 略
在电镜下可清晰地观察到大鼠一些心肌细胞的外膜和横小管膜上及胞质中有Y1 受体-LI，且存在于小泡中.Y1 受体为G蛋白偶联超家族受体，NPY作用于接后Y1 受体时，通过抑制性的G蛋白，可能对心肌产生负性肌力作用［9］ ，在这一过程中，均可引起细胞内钙离子变化.通常情况下，心肌细胞经横小管将兴奋传向终池，使肌浆网膜上的钙泵活动，肌浆内的钙离子浓度发生改变，从而引起心肌一系列变化［13］ .NPY可能通过作用于心肌外膜和横小管膜上的Y1 受体，对心肌收缩力产生影响.
我们的研究表明，大鼠心脏有较强的Y1 受体-Ir神经元，并具有较长的突起，可能为心内神经元，心内神经元主要为迷走神经的节后神经元，可单个存在.有研究报道心内神经元中有NPY反应阳性神经元［14］ ，因此来自心内神经元自分泌或旁分泌的NPY对其自身有调节作用，也可对其周围的心肌细胞产生作用，这也为Y1 受体可以是接前（prejunctional）受体提供了新的证据.已有的研究发现大鼠心脏有一种小强荧光细胞位于心肌细胞之间，有的在有孔毛细血管周围，可释放儿茶酚胺或其他物质到组织间隙或血管内，以内分泌和旁分泌的方式起局部调节作用［15］ .我们的研究发现Y1 受体-LI的心内神经元可与心内血管相临，特别是有时与血管腔只有一层内皮细胞之隔，因此Y1 受体-LI的心内神经元也可能是此小强荧光细胞，NPY通过对接前Y1 受体的作用，除对乙酰胆碱的释放起调节作用外，对儿茶酚胺或其他物质的释放也起调节作用.
参考文献:
［1］Wharton J，Gulbenkian S.Peptides in the mammalian cardiovas-cular system ［J］.Experentia Suppl，1989;56:292-316.
［2］Corr LA，Aberdeen JA，Milner P，Lincoln J，Burnstock G.Sympathetic and nonsympathetic neuropeptide Y-containing nerves in the rat myocardium and coronary arteries ［J］.Circ Res，1990;66（6）:1602-1609.
［3］Grundemar L，Hakanson R.Multiple neuropeptide Y receptors are involved in cardiovascular regulation.Peripheral and central mechanisms ［J］.Gen Pharm，1993;24（4）:785-796.
［4］Wahlestedt C，Regunathan S，Reis DJ.Identification of cultured selectively expressing Y
1 -，Y2 -or Y3 -type receptors for neu-ropeptide Y/peptide YY ［J］.Life Sci，1992;50（4）:PL7-PL12.
［5］Wharton J，Gordon L，Byrne J，Herzog H，Selbie LA，Moore K，Sullivan MH，Elder MG，Moscoso G，Taylor KM.Expres-sion of the human neuropeptide tyrosine Y1 receptor ［J］.Proc Nalt Acad Sci USA，1993;90（2）:687-691.
［6］Zhang X，Bao L，Xu ZQ，Kopp J，Arvidsson U，Elde R，Hok-felt T.Localization of neuropeptide Y Y1 receptors in the rat nervous system with special reference to somatic receptors on small dorsal root ganglion neurons ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91（24）:11738-11742.
［7］Bao L，Kopp J，Zhang X，Xu ZQ，Zhang LF，Wong H，Walsh J，Hokfelt T.Localization of neuropeptide Y Y1 receptors in cerebral blood vessels ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997;94（23）:12661-12666.
［8］Bao L，Lin YH，Zhang X.Distribution of neuropeptide Y Y1 re-ceptor-like immunoreactivity in rat coronary blood vessels ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;20（1）:1-5.
［9］McDermott BJ，Millar BC，Piper HM.Cardiovascular effects of neuropeptide Y:Receptor interactions and cellular mechanisms ［J］.Cardiovasc Res，1993;27（6）:893-905.
［10］Gu J，Polak JM，Allen JM，Huang WM，Sheppard MN，Tate-moto K，Bloom SR.High concentration of a novel peptide，neu-ropeptide Y，in the innervation of mouse and rat heart ［J］.J Histochem Cytochem，1984;32（5）:467-472.
［11］Balasubramaniam A，Sheriff S，Ferguson DG，Stein M，Rigel DF.Characterization of neuropeptide Y binding sites in rat car-diac ventricular membranes ［J］.Peptides，1990;11（6）:545-550.
［12］Michel MC，Schlicker E，Fink K，Boublik JH，Gothert M，Wil-lette RN，Daly RN，Hieble JP，Rivier JE，Motulsky HJ.Dis-tinction of NPY receptors in vitro and in vivo.I NPY（18-36）discriminates NPY receptor subtypes in vitro ［J］.Am J Physi-ol，1990;259（1Pt1）:E131-E139.
［13］Gu HY.Jizuzhi（Muscle）［A］.In:Cheng LZ.Zuzhixue Yu Peitaixue（Histology and embryology）［M］.4th ed.Beijing:Remin Weisheng Chubanshe（People’s Healthy Publishing House），1989:66-74.
［14］Gulbenkian S，Edvinsson L，Saetrum Opgaard O，Valenca A，Wharton J，Polak JM.Neuropeptide Y modulates the action of vasodilator agents in guinea-pig epicardial coronary arteries ［J］.Regul Pept，1992;40（3）:351-362.
［15］Lin FD，Li JS.Xinzang de shenjin（Cordis nerves）［A］.In:Lin FD，Lin Q.Xinzang linchuang jiepouxue（Clinic anatomy of the heart）［M］.Xi’an:Shaanxi Kexue Jishu Chubanshe（Shaanxi Scientific and Technique Publishing House），1996:123-131.