关键词: 增殖细胞核抗原;CD44;结肠直肠肿瘤;肝肿瘤/继发性;聚合酶链反应
摘 要:目的 研究伴有静脉侵袭的结直肠癌组织中增殖细胞核抗原（PCNA）和CD44mRNA的表达及其与肝转移的关系. 方法 采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测31例伴有静脉侵袭的结直肠癌组织中PCNA和CD44mR-NA的表达状况. 结果 PCNA和CD44mRNA在结直肠癌组织中阳性表达率分别为100%和64.5%.在有肝转移的结直肠癌组织中，PCNA和CD44mRNA的强表达率分别为94.1%和70.6%，表达强度明显高于无肝转移者（P&<0.05和P&<0.01）.PCNA和CD44的表达存在正相关（r=0.67，P&<0.05）. 结论 结直肠癌组织中PCNA和CD44的联合检测对判断癌细胞的肝转移具有一定的参考价值.
Keywords:proliferating cell nuclear antigen;CD44;colorec-tal neoplasms;liver neoplasms/secondary;poly-merase chain reaction
Abstract:AIM To investigate the expression of prolifera-ting cell nuclear antigen（PCNA）and CD44mRNA in venous invasional colorectal cancer and its relationship with liver metastasis.METHODS Reverse transcriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to detect the expressions of PCNA and CD44mRNA in31cases of colorectal cancer with liver metastasis.Theexpressions of PCNA and CD44mRNA in31cases of venous invasional colorectal cancer.RESULTS Positive expression rates of PCNA and CD44mRNA in the colorectal cancer were higher than those with-out liver metastasis（P&<0.05and P&<0.01）.In cases of col-orectal cancer with liver metastasis，94.1%and70.6%were strongly positive to PCNA and CD44mRNA，respectively，significantly higher than those without liver metastasis.There was a positive relationship between the expressions of PCNA and CD44（r=0.67，P&<0.05）.CONCLUSION De-tections of PCNA and CD44expressions in colorectal cancer might be useful for evaluating the liver metastasis of cancer cells.
0 引言
既往研究报道，静脉的侵袭程度与肿瘤肝转移的发生率和范围呈正相关.增殖细胞核抗原（prolifer-ating cell nuclear antigen，PCNA）作为细胞增殖活性的主要指标，与恶性肿瘤的侵袭转移与预后密切相关［1］ .而细胞粘附分子与肿瘤细胞的侵袭转移行为有关，在肿瘤的发生、发展和转移中发挥着作用［2］ .本文旨在用RT-PCR方法研究PCNA和粘附分子CD44mRNA在伴有严重静脉侵袭的结直肠癌组织中的表达，并探讨两者与结直肠癌肝转移的关系.
1 对象和方法
1.1 对象 本院收治的伴有严重静脉侵袭的结直肠癌31（男20，女11）例，年龄44～82（平均66）岁.按病理学诊断标准，结直肠癌静脉侵袭程度分为v0～v3，选取严重静脉侵袭的v3期病例作为研究对象，伴有肝转移者17例.术后立即将肿瘤标本投入液氮，-80℃保存备用.RNA抽提试剂盒购自Gibco公司;Taq酶购自Takara公司;PCNA、CD44及β-actin的引物均由上海博亚公司合成.PCNA的上游引物序列:5’-GCCGAGATCTCAGCCATATT-3’，下游引物:5’-ATGTACTTAGAGGTACAAAT-3’;CD44上游引物序列:5’-CTTCATCCCAGTGACC-TCAG-3’，下游引物:5’-TGCCACTGTTGATCAC-TAGC-3’;β-actin上游引物:5’-CACCATGTACC-CTGGCATTG-3’，下游引物:5’-TAACGCAAC-TAAGT CATAGT-3’.预期扩增产物的大小分别为452bp，446bp和243bp.
1.2 方法 利用TRIzol试剂盒（Gibco），按操作说明提取组织总RNA.分光光度计测量RNA纯度及含量，-80℃保存备用.在50μL的反应体积中加入5μg总RNA，5×反应缓冲液10μL，10mmol・L-1 dNTPs5μL，RNasin20U，oligo（dT）12-18 0.25μg，反转录酶（M-MLV，Gibco）200U，0.1mol・L-1 DTT0.5μL，置37℃孵育1h，65℃加热5min终止反应.在25μL反应体积中加入cDNA0.1μg，10×PCR缓冲液2.5μL，2mmol・L-1 dNTPs2.5μL，25mmol・L-1 MgCl2 2.5μL，各引物20pmol，Taq DNA聚合酶（Takara）5U.使用PTC-100PCR仪（MJ Research）进行热循环.循环条件:93℃1min预变性;93℃30s，56℃30s，72℃1min，35个循环;72℃延伸8min.取各扩增产物10μL，经3g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用UVP凝胶成像系统及Labworks软件进行检测和光量子强度分析，将PCNA和CD44阳性条带的密度与β-actin条带密度的比值作为PCNA和CD44mRNA的相对表达量.表达强度分为3级，+:占β-actin密度的1%～30%;:31%～65%;:66%～100%.
统计学处理:所有结果进行χ2 检验.
2 结果
2.1 PCNA和CD44mRNA在结直肠癌组织中的表达 RT-PCR方法在结直肠癌组织中分别检测到了PCNA，CD44和β-actin基因的表达，扩增片段的大小与预期的一致（Fig1）.在31例结直肠癌中均检测到了PCNA mRNA的表达，阳性率为100%，但其表达水平在不同病例中存在差异（Fig1A）.CD44mR-NA呈阳性表达者20例，阳性率为64.5%.在不同病例中，CD44mRNA的表达水平也存在差异（Fig1B）.作为内对照的β-actin在不同结直肠癌组织中的表达水平基本一致（Fig1C）. 2.2 PCNA和CD44mRNA的表达与肝转移的关系 在17例有肝转移的病例中，PCNA mRNA强表达（，）者有16例（94.1%），显著高于无肝转移者（28.6%，P&<0.01）.PCNA的强表达与结直肠癌的 肝转移呈正相关（r=0.82，P&<0.01），CD44mRNA在有肝转移的结直肠癌组织中的强表达12例，强表达率为70.6%，显著高于未发现肝转移者（21.4%，P&<0.05）.结直肠癌的肝转移与CD44的强表达呈正相关（r=0.82，P&<0.01）.
图1 略
2.3 PCNA与CD44在结直肠癌中表达之间的关系 在16例呈CD44mRNA强表达的病例中，12例同时呈PCNA mRNA强表达（75.0%）;在15例CD44mRNA阴性或弱表达的病例中，PCNA mR-NA强表达者7例（46.7%），两者间有显著性差异（P&<0.05）.CD44和PCNA的表达之间存在正相关（r=0.67，P&<0.05）.
3 讨论
癌细胞对静脉的侵袭被认为是肿瘤从原发灶向肝转移的第一步，本实验结果也与此相符.但在临床上，即使组织学检查证实有静脉侵袭的病例，不一定同时伴有肝脏的转移.这提示，除静脉侵袭外，一定还有其它的因素参与了结直肠癌的肝转移过程.
既往研究表明，PCNA与肿瘤的恶性程度、血管侵犯、远处转移及预后显著相关.我们观察到，在已有静脉侵袭的情况下，PCNA mRNA在伴有肝转移的结直肠癌中的强阳性表达率显著高于无肝转移的结直肠癌，表明PCNA的强表达与结直肠癌的肝转移呈正相关（r=0.82，P&<0.01），提示结直肠癌细胞的增殖活性越高，其进展越快，越容易发生肝转移.
近年来的研究表明，CD44可表达于不同肿瘤组织中［3］ .Bhatavdekar等［4］ 发现CD44过度表达与结直肠癌的临床分期有关，而且CD44阳性是与结直肠癌患者术后复发和总生存期有关的重要不良预后因素.进一步研究发现，CD44可使癌细胞获得转移能力，能够促进癌细胞与血管内皮的粘附，加速癌细胞的转移进程.我们观察到，在伴有肝转移的结直肠癌组织中，CD44mRNA的强表达率明显高于无肝转移者，进一步提示CD44可能在结直肠癌细胞的肝转移中发挥着重要作用.但是CD44能否作为结直肠癌进展和转移的独立指标尚存在争议.
我们还观察到，在已有静脉侵袭的情况下，伴有肝转移的结直肠癌病例往往同时呈PCNA和CD44mRNA强表达，提示在结直肠癌的肝转移、PCNA和CD44mRNA的强表达之间存在正相关性（r=0.82，P&<0.01）.另外，在CD44mRNA强表达的结直肠组织中，PCNA mRNA的强表达率显著高于CD44阴性或弱表达者中的强阳性表达率，表明CD44和PCNA的表达之间也存在正相关（r=0.67，P&<0.05）.上述结果提示对于已有静脉侵袭的结直肠癌病例，采用PCNA、CD44联合检测对判断其是否有肝转移具有一定的临床指导意义.
参考文献
［1］Choi HJ，Jung IK，Kim SS，Hong SH.Proliferating cell nuclear antigen expression and its relationship to malignancy potential in invasive colorectal carcinomas ［J］.Dis Colon Rectum，1997;40（1）:51-59.
［2］Li JF，Xu GW，Lin BY.Expression of CD44in different tumor tissues and its significance ［J］.Zhongguo Zhongliu（Bull Chin Cancer），2000;9（9）:403-405.
［3］Cao WD，Zhang X，Liu WP，Liu F，Liu XZ，Wang ZX.Ex-pression of CD44in meningiomas，glioblastomas multiform and brain metastases ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（10）:1292-1294.
［4］Bhatavdekar JM，Patel DD，Chikhlikar PR，Trivedi TI，Gosalia NM，Ghosh N，Shah NG，Vora HH，Suthar TP.Overexpres-sion of CD44:A useful independent predictor of prognosis in pa-tients with colorectal carcinomas ［J］.Ann Surg Oncol，1998;5（6）:495-501.