作者：张广梅 尹忠诚 赵淑芹
【摘要】 目的 观察不同剂量血管紧张素受体拮抗剂(ARB)缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏转化生长因子β1（TGF-β1）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）以及内皮素（ET）的影响，进一步探讨ARB对糖尿病大鼠肾脏的保护作用机制。方法 制备SD大鼠链脲佐菌素诱导的糖尿病（DM）模型，设正常对照组、糖尿病组、小剂量治疗组（缬沙坦10 mg·kg-1·d-1）、大剂量治疗组（缬沙坦50 mg·kg-1·d-1）；9周后采用免疫组织化学方法观察肾脏TGF-β1表达情况，放射免疫方法测定肾脏AngⅡ、ET的含量。结果 与正常对照组相比，糖尿病组大鼠肾AngⅡ、ET水平及TGF-β1表达明显升高(P&<0.01)；与糖尿病组相比，小剂量治疗组TGF-β1表达明显下降(P&<0.05)；与小剂量治疗组相比，大剂量治疗组AngⅡ、ET水平明显下降(P&<0.05)，但TGF-β1表达明显升高(P&<0.05)。结论 缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护作用大剂量优于小剂量；ARB对肾脏保护作用不完全，与激活肾内TGF-β1表达有关。
【关键词】 糖尿病;缬沙坦;转化生长因子β1;血管紧张素Ⅱ;内皮素
Abstract:Objective To investigate the effects of varied doses of angiotensin Ⅱ receptor antagonist (ARB) valsartan on intrarenal AngⅡ， ET and TGF-β1 in diabetic rats to explore the protective mechanism of ARB. Methods Streptozotocin-induced diabetic Sprague-Dawley rats were pided into an untreated control group， a group treated with smaller-dose valsartan and a group with bigger- dose valsartan， along with normal control group set up with healthy rats. The protein expression of TGF-β1 was determined by immunohistochemistry and the concentrations of AngⅡand ET were determined by radioimmunoassay in the 9th week.Results The expressions of TGF-β1， AngⅡ and ET were higher in the untreated diabetic group than those in the normal control group (P&<0.01). The concentrations of AngⅡ and ET were decreased (P&<0.01)， but the expression of TGF-β1 was increased (P&<0.05) in the group treated with bigger dose of valsartan， compared to that with smaller dose.Conclusion The renoprotective effect of bigger-dose valsartan is superior to that of the smaller-dose in DM rats. However， higher expression of TGF-β1 in the group treated with bigger doses suggests that the renoprotective effect of ARB is not complete and may be associated with the activation of TGF-β1 expression.
Key words: diabetes; valsartan; TGF-β1; AngⅡ; ET
糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）是糖尿病（diabetic mellitus， DM）的一种严重血管并发症，其发病机制复杂，与诸多因素有关。其中血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ， AngⅡ）、内皮素（endothelin， ET）及转化生长因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）等不仅对肾脏产生血流动力学影响，而且可促进细胞增生与肥大、细胞外基质（extracellular matrix， ECM）堆积、肾小管间质纤维化等。血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitor， ACEI）及血管紧张素受体阻断剂(angiotensin receptor blocker， ARB)已被作为临床治疗DN一线药物。Fujihara等［1］发现，传统剂量ARB不能完全阻滞肾脏过度激活的肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system， RAS），从而达不到完全肾脏保护作用。本研究目的在于观察不同剂量缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、AngⅡ以及ET的影响，进一步探讨ARB对DN肾脏的保护作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠40只，7～8周龄，体重180～220 g，购自徐州医学院实验动物中心。
1.2 药物及试剂 缬沙坦（代文）购自诺华公司，链脲佐菌素(streptozotocin， STZ )购自北京莱博公司，TGF-β1免疫组化试剂盒购自北京中杉公司，TGF-β1一抗 (rabbit antibody) 购自美国Santa Cruz公司，AngⅡ、ET 放射免疫试剂盒购自中国人民解放军东亚放免所。
1.3 实验仪器 LECIA Qwin图像处理与分析系统（德国 LECIA公司），DK-8D型电热恒温水槽（上海医用恒温设备厂），XH-6010γ计数仪（西安262厂），H-600型电镜（日本日立公司）。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组及处理 STZ 65 mg /kg 经腹腔注入，48～72 h 后血糖≥16.7 mmol/L，确认为糖尿病模型成功。模型鼠随机分成3组：①糖尿病组（D组），8只；②小剂量缬沙坦治疗组（DV10组），10只，缬沙坦10mg·kg-1·d-1灌胃；③大剂量缬沙坦治疗组（DV50组），12只，缬沙坦50 mg·kg-1·d-1灌胃。设正常对照组（C组），8只。造模成功后即予干预治疗，其中正常对照组和糖尿病组均给等量蒸馏水灌胃，至9周结束。所有动物自由饮食。处死前1天采用代谢笼收集24 h尿量，混匀后记录总量。动物空腹在３％水合氯醛麻醉下腹腔静脉穿刺，收集血标本，肾脏经生理盐水灌洗后称重，部分组织以10％甲醛固定，石蜡包埋，制成４ μm厚切片；其余组织液氮保存备用。
1.4.2 生化测定 血糖等的测定在日立7179A全自动生化分析仪上完成，24 h微量白蛋白测定采用散射比浊法，肾AngⅡ、ET含量采用放射免疫法测定。
1.4.3 免疫组织化学方法 采用卵白素－生物素复合物（ABC）技术。切片常规处理后加TGF-β1，37℃消化１ h。滴加兔抗TGF-β1（1∶50），37℃孵育１ h，然后加入生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200)， 37℃孵育１ h后滴加ABC复合物，37℃孵育45 min。最后加入DAB-h3O2显色液，显微镜下控制显色。实验同时采用正常兔血清和删除第一抗体的方法作为阴性对照。以肾脏细胞胞质内有棕黄色颗粒为阳性。
将免疫组化切片置OLYMPUS显微镜下（×400），对所测视野进行准确定位后由摄像系统提取数值化细胞图像输入LECIA Qwin图像处理与分析系统进行处理，每例随机选取15个完整而不重叠的视野进行定量分析，测定TGF-β1蛋白免疫组化反应阳性颗粒的平均光密度，取每张切片的均值作为该例的测量值。
1.4.4 肾脏病理学检查 肾组织经常规乙醇脱水，石蜡包埋，４ μm厚切片，常规脱蜡、水化，PBS缓冲液（pH7.4）冲洗3 次，作PAS染色，光镜下观察肾组织结构。肾皮质取材后经戊二醛固定，常规制作、切片，H-600型电镜下观察。
1.5 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件对数据分析处理，计量资料采用±s表示。多组间均数比较采用单因素方差分析和秩和检验，组间两两比较采用q检验，P&<0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 缬沙坦对体重、肾重等的影响 各组DM动物均出现明显的多尿、体重减轻、肾重增加以及血糖升高，干预治疗对这些指标无显著影响（表1）。与C组相比， D组大鼠24 h微量白蛋白分泌率（urinary albumin excretion rate， UAER）增高，小剂量缬沙坦治疗对此项指标有改善(P&<0.05)；与DV10组相比，DV50组此指标显著改善(P&<0.05)。见表1。表1 各组大鼠体重、肾重、血糖及UAER指标与C组比较：*P&<0.01；与D组比较：＃P&<0.05，＃＃P&<0.01；与DV10组比较：△P&<0.05
2.2 缬沙坦对AngⅡ、ET、TGF-β1的影响 与C组相比，肾组织中AngⅡ、ET的含量、TGF-β1表达（肾脏细胞胞质中棕黄色颗粒，图1）在D组增高（P&<0.01）；与D组相比，AngⅡ含量、TGF-β1表达在DV10组有下降(P&<0.05)；与DV10组相比，AngⅡ、ET的含量在DV50组明显下降(P&<0.05)，但TGF-β1表达增高(P&<0.05)。见表2。表2 各组大鼠肾组织中AngⅡ、ET含量、TGF-β1表达与C组相比较，*P&<0.01；与DV10组比较，＃P&<0.05， ＃＃P&<0.01；与D组比较，△P&<0.05，△△P&<0.01
2.3 各组大鼠肾脏病理结果 光镜下：正常对照组未见明显异常；糖尿病组系膜区基质增多、基底膜增厚；与糖尿病组相比，小剂量治疗组无明显改变，大剂量治疗组上述病变减轻（图2）。电镜下：正常对照组未见明显异常；糖尿病组基底膜增厚，系膜基质增多，形成系膜插入，并有足突融合现象，符合DN肾脏病理改变；与糖尿病组相比，小剂量治疗组无明显改变，大剂量治疗组上述病变减轻（图3）。
DN是引起糖尿病患者死亡的主要原因之一。由胰岛素代谢障碍而导致的长期高血糖是DN 发生的最关键原因，高血糖造成肾脏动力学改变以及葡萄糖本身代谢异常所致的一系列后果是造成肾脏病变的基础，众多生长因子、细胞因子被激活则是病变形成的直接机制［2］。尤其AngⅡ与TGF-β1、ET 获得广泛关注，它们在各种肾脏疾病包括DN 中起着重要病理作用。
本实验数据显示，糖尿病大鼠肾组织AngⅡ、ET含量、TGF-β1表达水平明显增加，与既往研究结果一致；不同剂量缬沙坦对糖尿病大鼠肾组织AngⅡ、ET含量、TGF-β1表达影响不同。小剂量虽可降低AngⅡ及ET水平，但效果不如大剂量缬沙坦明显；免疫组织化学显示小剂量缬沙坦可明显降低肾组织TGF-β1表达，较大剂量也可减少其表达，但与小剂量相比，TGF-β1表达有增加。研究还发现，剂量愈大，对蛋白尿减少程度愈明显。病理结果显示，缬沙坦治疗能部分缓解糖尿病大鼠肾脏改变。
AngⅡ呈剂量、时间依赖式增加TGF-β1的表达及促进其活化。用ACEI 或（和）ARB阻断AngⅡ的作用可使肾内TGF-β1 表达下降，延缓肾纤维化的进展。Brezniceanu等［3］发现，在大鼠近端肾小管细胞TGF-β1可以 刺激血管紧张素原基因表达，因此，AngⅡ与TGF-β1形成了一个正反馈机制来加强各自基因表达，从而导致肾脏损害。本研究也发现，缬沙坦治疗后肾组织 AngⅡ下降同时，TGF-β1表达水平也下降，支持此结论。
ET和AngⅡ之间的相互影响在调节肾小球功能、基质和细胞生长方面起重要作用，Ang Ⅱ可促进内皮细胞和系膜细胞中ET-1的基因表达和蛋白释放，ET-1也可增加内皮细胞血管紧张素转换酶的活性。我们发现缬沙坦治疗后不仅糖尿病大鼠肾组织AngⅡ含量下降，ET的含量亦下降，提示缬沙坦可能通过减少肾组织AngⅡ的生成来降低ET的含量。
以上说明，ARB减少尿蛋白的机制除了有降低系统血压以及肾内压力、降低肾小球通透性、减少细胞外基质积聚、使nephrin基因表达正常化等，还可以通过抑制ET、TGF-β1表达来达到肾脏保护作用。
Fujihara等［1］发现，传统剂量ARB不能完全阻滞肾脏过度激活的肾素-血管紧张素系统，由于此类药物具有很好耐受性，因而可以认为，以目前认为“极大”剂量（氯沙坦500 mg·kg-1·d-1，10倍于传统剂量）的ARB治疗肾脏疾病，可能会得到更加有效的肾脏保护效果。这与我们的研究结果一致，更大剂量的缬沙坦在降低肾脏AngⅡ、ET含量及尿蛋白、缓解肾脏病理方面具有更好的作用。
然而，我们也发现，小剂量缬沙坦降低肾组织TGF-β1表达更明显，与其相比，较大剂量治疗TGF-β1表达反而有增加。Huang 等［4］研究发现，在人和大鼠系膜细胞分布着肾素受体，体外试验中肾素可通过受体介导的非依赖于AngⅡ生成的机制快速地增加TGF-β1产生，而应用ACEI或ARB治疗后可引起血和肾内肾素反馈性增高，进而增加肾内TGF-β1表达，并逐步刺激血纤溶酶原激活物抑制因子-1、纤连蛋白及胶原Ⅰ合成，进一步引起肾脏损害。这与我们实验中观察的结果一致。Suissa等［5］通过一项长达10余年对6000余名分别使用不同抗高血压药物的糖尿病患者追踪调查发现，ACEI类药物应用不仅没有降低糖尿病人发展至终末期肾衰竭的危险，反而可能增加这种危险。Katayama等［6］发现，ARB联合cilnidipine （L/N型钙离子通道阻滞剂）治疗2型糖尿病患者比单一应用ARB具有更好的降蛋白尿效果。实验中病理结果也显示，即使较大剂量缬沙坦亦未能完全缓解DN病理改变。以上结果表明，ARB治疗DN有一定局限性 ，不能获得完全肾脏保护效果，可能与激活肾内TGF-β1表达有关。
总之，缬沙坦对肾脏保护作用大剂量优于小剂量，最大作用可能需要数倍于目前所常用剂量，需要更大规模、更长时间动物实验及临床试验来提供最佳作用剂量。ARB对于肾脏保护作用不完全，可能与激活肾内TGF-β1表达有关，对于糖尿病肾病治疗需要联合治疗。
参考文献
［1］ Fujihara CK， Velho M， Malheiros DMAC， et al． An extremely high dose of losartan affords superior renoprotection in the remnant model［Ｊ］. Kidney Int， 2005，67(5):1913-1924.
［2］ 林善锬.糖尿病肾病［J］.中华内科杂志，2005，44(3):229-231.
［3］ Brezniceanu ML， Wei CC， Zhang SL， et al. Tansforming growth factor-beta 1 stimulates angiotensinogen gene expression in kidney proximal tubular cells［J］. Kidney Int， 2006，69(11):1977-1985.
［4］ Huang Y， Wongamorntham S， Kasting J， et al. Renin increases mesangial cell transforming growth factor-β1 and matrix proteins through receptor-mediated angiotensinⅡ-independent mechanisms［J］. Kidney Int， 2006，69(1): 105-113.
［5］ Suissa S， Hutchinson T， Brophy JM， et al. ACE-inhibitor use and the long-term risk of failure in diabetes［J］. Kidney Int， 2006，69(5):913-919.
［6］ Katayama K， Nomura S， Ishikawa H， et al. Comparison between valsartan and valsartan plus cilnidipine in type Ⅱ diabetics with normo-and microalbuminuria［J］. Kidney Int， 2006，70(1):151-156.
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