关于戊四氮诱导发育鼠癫

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【关键词】 戊四
　　摘要 :目的 探讨戊四氮诱导发育鼠癫持续状态（SE）后海马结构的突触重建以及NMDA受体在其中的作用。 方法 利用图像分析仪测定戊四氮诱导的发育鼠癫持续状态模型及用NMDA受体拮抗剂MK-801治疗后海马结构内CA3区及齿状回内分子层突触素（p38）的阳性免疫反应产物的光密度值（A）。 结果 不同日龄SD大鼠SE后海马结构内各部p38阳性免疫反应产物光密度值较对照组显著增加，尤以CA3区苔藓纤维层和齿状回分子层内带为甚;MK-801可显著减少p38的表达。 结论 癫持续状态后存在突触重建现象，一方面是癫发作的结果，另一方面也可能是导致癫反复发作的分子学基础;在此过程中NMDA受体发挥着重要的作用。
　　
　　关键词 :发育鼠;癫持续状态;突触素;齿状回;MK-801
　　
　　Abstract:Objective To study the synaptic reorganization of hippocampal formation after pentylenetetrazol-induced sta-tus epilepticus in developing rats and the effect of NMDA receptor antagonist MK-801on it.Methods The optical density（A）of synaptophysin（p38）immunoreactive product was examined by image pattern analysis in the hippocampus of developing rats associated with pentylenetetrazol-induced status epilepticus and MK-801treatment.Results The A of p38positive im-munoreactive product in hippocmpal formation in the epileptic group was higher than that in the control，especially in the mossy fiber layer of the CA3and the inner molecular layer of the dentate gyrus.The A in MK-801group was lower significantly than in epileptic group.Conclusion The increase of p38expression（related to synaptic reorganization）may be the result from the status epilepticus，as well as the molecular basis of the repeated seizures.NMDA receptors play an important role in the synaptic reorganization.
　　
　　Key words:developing rats;status epilepticus;synaptophysin;dentate gyrus;MK-801
　　
　　癫是最常见的神经系统疾病之一，是由于脑细胞的突然放电所引起反复性惊厥发作。其中癫持续状态（status epilepticus，SE）因能够造成严重的全身性和神经元的损伤而受到重视。近年来，在不同的动物癫模型及人类癫灶的形态学研究中发现了突触重建现象，被认为是癫发生后中枢神经系统可塑性变化的重要反映［1］ 。突触素（synaptophysin，p38）系一相对分子质量为38000的钙结合糖蛋白，位于小突触囊泡上，在神经元胞体合成后被转运至轴突终末贮存。p38作为突触囊泡的一种特异标志性蛋白，其密度和分布可间接反映体内突触的数量和分布情况，从而反映出突触结构和功能的变化，与突触重建密切相关［2］ 。
　　
　　许多研究表明，成年大鼠在SE发作后海马等结构中存在明显的突触重建现象，而本研究建立不同年龄幼鼠戊四氮（pentylenetetrazol，PTZ）致SE模型，采用免疫组织化学方法动态观察p38在发育鼠海马内的表达，并研究应用非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂MK-801对其表达的影响，以探讨发育期致动物海马突触功能、突触重构变化过程及NMDA受体在突触重建中的作用。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 试验动物和试剂
　　
　　1.1.1 实验动物 健康SD大鼠7天、14天、21天、28天4个日龄组，雌雄不限，各组均为54只，由徐州医学院实验动物中心提供。随机分为癫持续状态组（SE组）、MK-801治疗组（MK-801组）和对照组（NS组），每组各6只。
　　
　　1.1.2 试剂 鼠抗p38单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司产品;SP免疫组化染色试剂盒，美国ZYMED公司产品;PTZ、MK-801为美国Sigma公司产品。
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 癫持续状态模型的建立和分组处理 各日龄大鼠的SE组与MK-801组腹腔内注射PTZ（80mg.kg，用生理盐水稀释成100g.L），发作开始时的表现按Lado幼鼠癫发作分级标准［3］ 评价，均达到3.5～8级发作，呈癫持续状态，发作1h3组均给予地西泮腹腔内注射（10mg.kg）以终止发作，MK-801组给地西泮同时腹腔内注射MK-801，剂量为1mg.kg（用生理盐水稀释成0.5g.L）。各日龄大鼠NS组用与PTZ等体积的生理盐水腹腔内注射，1h后亦给予同剂量的地西泮腹腔注射。所有大鼠均在同一实验室和动物中心操作和喂养，以保持喂养、光照、噪声等条件相同，减少外界干扰造成的差异。
　　
　　1.2.2 组织切片的制备 4个日龄组分别于发作后第7、14、28天（每一时间点各组均为6只）腹腔内注射10%水合氯醛（0.35ml.kg）麻醉，4%多聚甲醛左心灌注固定取脑。在海马部位做连续冠状冰冻切片，切片厚30μm，每隔2张取1张切片，每例标本（双侧海马结构）取切片不少于8张。
　　
　　1.2.3 免疫组织化学染色 以鼠抗p38单克隆抗体（1∶100）作为一抗，采用SP法行p38免疫组织化学染色，用DAB和H 2 O 2 呈色，自来水冲洗，贴片，脱水，透明，封片。棕黄色着色为阳性。阴性对照试验以PBS代替一抗，其余染色步骤相同。
　　
　　1.2.4 结果判定 p38免疫反应产物的标记强度以光密度值（A）表示，应用LEICA Qwin图像处理与分析系统（德国）测定齿状回分子层内带与海马CA3区苔藓纤维层等部位，每个部位测定10个视野的A值（分别为A1、A2……A10），同时测定同一张切片的胼胝体的A值（A 0 ）作为背景，计算出校正A值（CA值）:CA=（A1+A2+……+A10）.10-A 0 。每例标本被检各区测6张切片，该例标本的p38免疫反应产物A值为各片CA的平均值。
　　
　　1.3 统计学处理 所得结果以ˉx±s表示，应用SPSS11.5软件进行统计学处理，采用单因素方差分析（ANOVA）进行显著性差异分析，检验水准:α=0.05。
　　2 结果
　　
　　2.1 行为学观察 SE组与MK-801组大鼠注射PTZ后1～2min进入潜伏期，由自由活动状态逐渐转为安静、呼吸加快，很快出现癫发作，渐次出现连续点头、前肢阵挛、后退、摔倒;7～8级发作的大鼠则表现为狂奔嘶叫、全身强直-阵挛性发作，同时伴有全身青紫。NS组大鼠无行为学改变。
　　2.2 p38免疫反应产物
　　
　　2.2.1 NS组 NS组切片的海马结构内p38免疫反应产物呈板层样分布，神经毡内免疫反应产物呈特异性点状或颗粒状沉积，多为细颗粒状沉积，神经元胞质、胶质细胞、血管及白质不被染色。在海马CA3区苔藓纤维层内，深染的颗粒状免疫反应产物较为均匀分布，整体呈月牙形（图1A）。在齿状回内分子层内带染色最深，颗粒细胞轮廓边缘也有点状反应产物沉积（图1B）。阴性对照实验切片无特征性免疫反应产物。各日龄组切片经分析比较，14、21与28日龄鼠的p38的表达逐渐增加，且两两比较有显著性差异（P&<0.05），但35、42、49、56日龄鼠较28日龄鼠均无显著性差异（P&>0.05）。图2示NS组不同日龄鼠p38的表达趋势。
　　图1 海马结构内突触素p38免疫反应产物（略）
　　
　　A:箭头示CA3区苔藓纤维层（免疫组化染色，×100）B:箭头示齿状回分子层内带（免疫组化染色，×40）

　　图2 NS组不同日龄鼠p38的表达趋势（略）
　　
　　2.2.2 SE组与MK-801组 SE组海马结构内p38免疫反应产物的分布特征无明显变化。定量结果显示，各日龄组在癫发作后各个时间点海马CA3区苔藓纤维层、齿状回分子层内带p38免疫反应产物CA值显著增加（P&<0.05），其中均以发作后14天增加达最高峰。
　　
　　MK-801组齿状回分子层内带及CA3区苔藓纤维层p38免疫反应产物CA值较各日龄SE组各个时间点均显著降低（P&<0.01），见表1。
　　表1 3组大鼠海马结构内p38免疫反应产物CA的比较（略）
　　
　　与NS组比较:*P&<0.05，**P&<0.01;与PTZ组比较:#P&<0.05，##P&<0.01
　　
　　3 讨论
　　
　　目前，对癫反复发作的病因的说法很多，但颗粒细胞的苔藓纤维异常发芽及伴随的突触重建已被认为是其细胞机制之一。即神经系统因癫或其他因素作用受损后，现存的神经元可通过轴突出芽形成不同的径路与原有的突触后位点或新的突触后位点发生接触，形成新的突触。同时，平时处于休眠状态的侧支和突触联系被激活，从而完成神经回路的改造和突触的重组，由此导致突触可塑性发生变化。
　　
　　p38于1985由Jahn等［4］ 从大鼠脑突触囊泡中提取，它几乎存在于所有神经终末的突触囊泡膜上，是一种重要的囊泡膜标志蛋白，参与多种突触相关活动，如参与Ca 2+ 依赖性神经递质释放过程，并与长时程增强（long-term potentiation，LTP）的诱导与维持有关［5］ 。免疫组织化学显示，颗粒样p38免疫反应产物基本上反映了被检区突触的分布和密度。经电镜证实，光镜下标记的p38颗粒样结构实际上就是成簇的囊泡。由于p38含量与突触密度呈正相关，因此借助图像分析系统测量p38免疫产物的平均光密度值可推测突触数量或密度，从而反映出突触结构和功能的变化，并达到在光镜水平分析超微结构的目的［6］ 。以往研究证明，正常大鼠中枢突触发育过程主要在生后3周内完成［7］ 。沈丽等［8］ 对大鼠海马突触发育可塑性进行研究发现大鼠海马CA1区生后20天至30天突触数目仍有所增长，说明CA1区突触数目增殖可持续至生后1个月，但20天突触较30天突触幼稚。本试验结果显示NS组28日龄幼鼠p38的表达较14、21日龄有显著性差异（P&<0.01），但比较35、42、49、56日龄均无显著性差异（P&>0.05），说明大鼠脑内突触的发育在28天左右完成。本试验发现，SE发作可使得大鼠脑内结构，尤其是海马内CA3的苔藓纤维层和齿状回分子层内带p38表达显著增加。

由于胶质细胞不表达p38，因此实验所见的p38增加可能主要由于神经元活动所致。但是p38免疫活性增高的机制目前仍不十分清楚，许多研究表明癫过程中常伴有海马结构内选择性神经元丢失［9］ ，神经元的丢失可使下位突触空缺，存活的神经元的轴突在失去靶器官后，就会出现轴突的出芽和形成许多侧支，填补丢失神经元留下的空间，并与其他神经元建立新的突触联系，构成异常的神经网络，因此其突触前囊泡的数量可能增加，另外也可能与突触前膜功能代偿性增加有关。Chen等［10］ 在大鼠局部皮质注射海人酸的脑区也发现p38免疫组化反应增强和神经元脱失，提示p38表达增强是神经元损伤的结果。综合既往研究，我们认为SE发作与p38表达增强之间关系可能为:①癫发作后大量Ca 2+ 内流，激活了Ca 2+ .CaM依赖性蛋白激酶系统，促进兴奋性氨基酸释放［11］，p38蛋白正是Ca 2+ .CaM依赖性蛋白激酶［12］ 。②惊厥后NMDA受体活性的增高，谷氨酸过量释放后，一方面介导兴奋毒性损害，导致神经元坏死或凋亡;另一方面也启动了一些神营养因子的表达，特别是脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达，而p38是BDNF酪氨酸激酶级联反应通路的下游应答分子，从而在突触可塑性及其突触功能发挥中有重要作用。③袁宝强等［13］ 研究发现，以c-fos为代表的即刻早基因（IEGs）在惊厥发作后其mRNA在海马等部位表达增强。Smeyne等［14］ 亦研究发现，海人酸大鼠腹腔注射后c-fos mRNA在海马的表达增强，反映了神经元胞体对突起再生的调控。c-fos作为核内第三信使，参与启动和调控系列靶基因的表达，而p38基因是受IEGs调控的靶基因之一［15］ 。因此，p38蛋白表达增强可能与IEGs表达调控有关。④我们前期工作已观察到单次惊厥发作后海马区神经元细胞核中细胞核因子κB（NF-κB）表达明显增加，且可能诱导了神经细胞的凋亡。NF-κB作为多极基因调控蛋白，可调控神经突触重组的过程［16］ ，它在静息状态下位于细胞质中，SE发作后NF-κB被激活，转位入核，参与神经元的激活过程，进而调节突触活动。
　　
　　本试验发现，SE发作后p38免疫反应产物的增加一直持续到试验终点28天，推测海马p38免疫反应产物增加，一方面是癫发作的结果，另一方面也可能是癫慢性反复发作的分子病理学基础。考虑由于当出芽侧支回返时，可穿过颗粒细胞层到达齿状回分子层或穿过CA3锥体细胞层到达CA3始层形成突触联系，海马结构的突触调整，构成了密乱的反复兴奋环路，激动信号在环路中不断振荡，自我放大和增强，可导致癫反复发作。NMDA受体是广泛分布于中枢神经系统的谷氨酸敏感离子通道受体，在癫的发生、发展和维持中起着重要的作用。它是一种具有许多不同变构调控位点并对Ca 2+ 高度通透的配体门控离子通道，它不仅通过调节钙离子内流，保持神经元正常的生理功能，同时与中枢神经系统的发育、可塑性密切相关，并参与缺氧缺血性脑损伤、癫和大脑退行性变等损伤的病理生理过程［17］ 。MK-801是一个强有力、非竞争性的NMDA型受体拮抗剂，富亲脂性，易于通过血脑屏障，能有效地、选择性地作用于具有此受体的海马神经细胞，而且NMDA受体上MK-801非竞争性拮抗部位在不成熟大鼠比成年大鼠敏感［18］ 。MK-801结合于与受体耦联的离子通道内部，从而阻断Ca 2+ 内流，减轻Ca 2+ 超载，减少神经元的损伤，保护神经细胞，从而减少癫后神经发生与突触重建。本实验对不同日龄组的幼鼠应用MK-801后发现p38的表达在各个日龄组各个时间点较PTZ组均显著降低（P&<0.01），说明NMDA受体在p38的表达中起着重要的作用。
　　
　　本实验动态观察了PTZ致癫持续状态后海马突触素的改变，结果说明在生理状态下SD大鼠脑内p38在生后28天即达高峰;而SE发作后突触素表达显著增强，提示SE发作后海马等结构内存在神经元的突触重建现象，因而这些结构的神经可塑性发生改变，并由此可能导致神经生理功能的改变，继而可能成为癫反复发作的解剖基础。
　　

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