人胎膜体外孵育方法分析

【关键词】 人胎
　　摘要 :目的 探讨人胎膜体外孵育的方法，为进一步研究胎膜的结构和功能提供一种新的方法。 方法 取20例正常选择性剖宫产者的胎膜，在DMEM.F-12培养基中进行孵育，共孵育96h，每24h换液并测定胎膜的存活力，48h后一部分胎膜分别给予细菌内毒素脂多糖（LPS）和LPS+N-乙酰半胱氨酸（NAC）刺激孵育中的胎膜24h。苏木精-伊红染色观察细胞形态，免疫组化方法检测各时间点胎膜中的基质金属酶-9（MMP-9）的表达情况，了解胎膜细胞的功能。 结果 20例胎膜的平均存活力24h为87%±1.9%，48h为85%±1.3%，72h为83%±1.6%，96h为37%±1.2%;前三者两两比较无统计学差异（P&>0.05），前三者分别与96h组比较均有统计学差异（P&<0.05）。苏木精-伊红染色观察细胞形态变化，0～72h细胞形态良好、饱满，72h后细胞开始皱缩，至96h大部分细胞死亡。免疫组化示0h及48h的胎膜MMP-9的表达微弱，24h的MMP-9表达较前增强，LPS作用后MMP-9的表达明显增强，同时给予LPS+NAC的MMP-9表达又明显下降。 结论 DMEM.F-12培养基体外孵育胎膜是可行的，且方法简单。
　　
　　关键词 :胎膜;体外孵育;方法;脂多糖;N-乙酰半胱氨酸
　　
　　胎膜在整个妊娠中发挥着重要的作用，一旦胎膜的结构和功能发生变化，妊娠将不能维持;但是胎膜的结构和功能的某些变化在临床出现症状（如胎膜早破）前往往不为人所发觉，因此体外孵育胎膜进一步研究其结构和功能将有非常重要的意义。本实验建立了一种简单、可行的体外孵育胎膜的方法。
　　
　　1 资料和方法
　　
　　1.1 胎膜来源 所有胎膜均来源于东南大学附属中大医院妇产科2004年10月―2005年3月单胎足月择期剖宫产的孕妇（20例），孕妇无妊娠合并症及并发症，也无临产征兆，所有孕妇除接受麻醉药外未接受其他药物治疗。排除有感染征象（血、尿常规有白细胞升高，C反应蛋白异常升高，体温高于正常，胎膜经苏木精-伊红染色后每高倍视野白细胞超过5个）及有过自然早产或早产并发胎膜早破史者，以及此次妊娠用过抗生素者。
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 胎膜的取材及孵育 剖宫产胎盘取出后10min内进行取材，所取的胎膜位于胎盘边缘和破口之间，包含绒毛膜和羊膜两层，大小约10cm×10cm，取材之前先用生理盐水纱布尽可能擦去胎膜表面的血液，取下后立即放入装有Hanks液（4℃）的瓶中，10min内送至实验室后在超净台内把所取的胎膜放入装有Hanks液的培养皿中进行反复漂洗，直至肉眼观察无血液，再用DMEM.F-12培养液洗1次，然后把胎膜剪成24块0.6cm×0.6cm大小，放入装有DMEM.F-12培养液（含1×10 5 U.L青霉素，0.1g.L链霉素）的24孔培养板中，每孔1块组织，加培养液2ml。培养板置5%CO 2 、95%O 2 、37℃的培养箱中进行孵育，共孵育96h，每24h换液1次。孵育48h后其中的8块胎膜再分别给予脂多糖（LPS，0.1mg.L，由O55:B5型菌株产生，Sigma公司，北京中杉公司代理）和LPS+N-乙酰半胱氨酸（NAC，10mmol.L，Sigma公司，北京中杉公司代理）作用24h。
　　1.2.2 胎膜存活力检测 胎膜存活力检测每24h为一个检测点，即24、48、72和96h。在每个检测点，用CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity试验检测培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）含量，孵育后的胎膜用1%Triton X-100计算其LDH的最大产量，胎膜存活力=100×〔（1-培养基中产生的LDH的量）.胎膜中应产生的LDH最大量〕，最后计算各时点20例孵育胎膜的平均存活力。
　　
　　1.2.3 苏木精-伊红染色及免疫组化 苏木精-伊红染色及免疫组化均增加一个0h时点，免疫组化取消了96h时点，其中72h组又分成LPS组和LPS+NAC组。每组孵育的胎膜经10%中性甲醛固定24h，石蜡包埋，4μm连续切片，经苏木精-伊红染色进行细胞的形态学观察。免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）连接法，操作步骤按试剂盒说明进行，二氨基联苯胺（DAB）显色（MMP-9单克隆一抗及SP法试剂盒为北京中杉公司产品）。用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗，按同前步骤平行操作，其染色作为阴性对照。
　　
　　染色阳性为细胞质出现棕黄色颗粒。采用半定量积分法，根据切片阳性细胞率和阳性细胞着色强度分别计分。阳性细胞率以计数5个高倍视野为准，≤5%计0分，6%～30%计1分，31%～50%计2分，≥51%计3分。基本未着色，染色强度与背景相似者，计0分;着色浅，略高于背景色，计1分;中等着色，明显高于背景色，计2分;强染，着色深者，计3分。两项相加得分分为4级:0～1分为阴性（-），2分为弱阳性（+），3～4分为中等强度阳性（++），5分及以上为强阳性（+++）。
　　
　　1.3 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，计量资料采用t检验，染色评分的比较采用Mann-Whitney检验，检验水准:α=0.05。
　　2 结果
　　
　　2.1 胎膜孵育 在DMEM.F-12培养基中孵育的胎膜生长良好，换液时各培养孔中的培养液均由樱桃红色变成淡橙色，组织颜色鲜艳，有些组织边缘见有细胞生长。20例胎膜孵育后的总存活力24h为87%±1.9%，48h为85%±1.3%，72h为83%±1.6%，96h为37%±1.2%;前3组两两比较差异无统计学意义（P&>0.05），但每组和96h组比较差异均有统计学意义（P&<0.05）。
　　
　　2.2 苏木精-伊红染色 0～72h各组胎膜苏木精-伊红染色后均可见大多数细胞饱满，胞膜完整无皱缩，胞质丰富，核无碎裂、固缩等细胞死亡现象，孵育96h后可见细胞开始皱缩，胞质减少，核碎裂。 　2.3 免疫组化染色 在0h及48h，孵育的胎膜中几乎不表达MMP-9，阳性细胞率分别为8%和6%，细胞质着色浅黄（图1、2）。24h时MMP-9表达增强，阳性细胞率为32%，细胞质着色黄（图3）。72h时羊膜上皮细胞及绒毛膜滋养层细胞表达MMP-9，胞质呈棕黄色;LPS组表达最强，阳性细胞率为76%，细胞质着色深棕色（图4）;LPS+NAC组表达减弱，阳性细胞率为47%，细胞质着色浅棕色（图5），其阳性率和LPS组比较有显著差异（P&<0.05）。因苏木精-伊红染色示胎膜孵育96h后细胞开始死亡，故未作免疫组化检查。

　　图1 0h时MMP-9几乎不表达（SP法染色，×100）
　　
　　图2 48h时MMP-9几乎不表达（SP法染色，×100）

　　图3 24h时MMP-9弱阳性表达（SP法染色，×200）
　　
　　图4 72h时LPS组MMP-9强阳性表达（SP法染色，×300）
　　
　　图5 72h时LPS+NAC组MMP-9中等阳性表达（SP法染色，×200）
　　
　　3 讨论
　　
　　胎膜主要由羊膜和绒毛膜组成，两者由富含Ⅳ型胶原的基底膜相连，由于羊膜上皮细胞和绒毛膜滋养细胞是胎膜的主要细胞，细胞排列成单层，在培养基中孵育时，可以汲取有效的营养成分维持细胞的活性，从每天换液见培养基的颜色由樱桃红色变为淡橙色（说明培养基中的营养成分被吸收）以及部分胎膜的边缘有细胞生长可以证实这一点，且胎膜的活力检测也证实体外孵育胎膜是可行的。本实验把胎膜作为一个整体，保持了其结构和功能的完整性，更接近生理状态。
　　
　　胎膜结构和功能的维持部分依赖羊水的营养， 羊水中主要的电解质为Na + 、Cl - 、K + 、HCO -3 、Mg 2+ 、Ca 2+ 等，还有葡萄糖、氨基酸、脂肪酸及酶等有机物质，DMEM.F-12培养基中几乎包含了羊水中的所有营养成分，pH值约7.2，加上适宜的培养温度，因此胎膜在其中孵育时能保持活性。本实验观察到孵育72h后胎膜的细胞开始死亡，提示胎膜的功能和结构的维持还有赖于完整的机体。
　　
　　人体内几乎所有的细胞均可分泌MMP-9，正常情况下，胎膜中的羊膜上皮细胞及平滑绒毛膜细胞可分泌极少量的MMP-9，一般的实验方法几乎测不出，而胎膜有感染时MMP-9的分泌将明显增加。本实验之所选用MMP-9作为检测细胞活性的指标，是因为有实验证实:体外孵育的胎膜存活时，在LPS干预后其表达量会有明显的增加，NAC和LPS同时作用时MMP-9的表达又会下降;24h表达量上升，这是因为体外孵育24h后因内源性LPS的作用，MMP-9的表达会升高，48h后内源性LPS消耗殆尽，MMP-9的表达量将会降低到最低水平［1］ ，以此为指标可以间接反映细胞的存活情况，本实验的结果也证明了这一点。因苏木精-伊红染色观察到胎膜孵育96h后细胞大多数死亡，存活力明显下降，故LPS和NAC只干预24h。
　　
　　从本实验可以看出，NAC可逆转LPS引起的MMP-9的产生，其机制可能是:炎症可产生活性氧，基质金属蛋白酶（MMPs）在活性氧的作用下其水平升高，NAC可抑制组织内在的超氧化离子的产生，从而抑制MMPs的产生［2］ 。
　　
　　为保证体外孵育胎膜的成功，我们的经验是:①胎盘娩出后尽可能在最短时间内（一般不超过10min）取材，立即放入平衡盐溶液（本实验使用Hanks液）中尽快送至实验室;②漂洗时动作要快、轻柔;③需培养的每块胎膜不宜过大，以免培养时培养基相对不足而致部分细胞死亡（实验刚开始时培养板每孔所放的胎膜较大，约1cm 2 ，胎膜的存活力较低）;④整个操作过程严格无菌操作，以防细菌汲取培养基的营养成分。
　　
　　综上所述，本实验建立的体外孵育胎膜方法是简单、可行的。
　　参考文献 :
　　
　　［1］ Fortunato SJ，Lombardi SJ，Menon R.Racial disparity in membrane re-sponse to infectious stimuli:a possible explanation for observed differ-ences in the incidence of prematurity［J］.Am J Obstet Gynecol，2004，190（6）:1557-1562.
　　
　　［2］ Weiss A，Goldman S，Shlomo IB，et al.Mechanisms of matrix metallo-proteinase-9and matrix metalloproteinase-2inhibition by N-ace-tylcysteine in the human term decidua and fetal membranes［J］.Am J Obstet Gynecol，2003，189（6）:1758-1763.