【摘要】 目的 观察血管紧张素受体拮抗剂(ARB)缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏内皮素受体A（ETA）、内皮素受体B（ETB）基因表达的影响。方法 SD大鼠，制备链脲佐菌素诱导的糖尿病（DM）模型，设正常对照组、糖尿病对照组、小剂量缬沙坦治疗组（10 mg· kg-1·d-1）、大剂量缬沙坦治疗组（50 mg·kg-1·d-1）、极大剂量治疗组（100 mg·kg-1·d-1）。9周后采用逆转录-聚合酶链反应方法观察肾脏ETA、ETB基因表达情况。结果 与正常对照组相比，糖尿病对照组大鼠肾ETA、ETB基因表达明显升高(P&<0.01)；与小剂量治疗组相比，大剂量治疗组上述指标明显改善(P&<0.01)；与大剂量治疗组相比，极大剂量治疗组上述指标无明显变化。结论 缬沙坦通过降低肾内ETA、ETB表达而达到肾脏保护作用，而且此效应大剂量优于小剂量。
【关键词】 糖尿病 缬沙坦 内皮素受体 基因表达
Abstract：Objective To study the effects of angiotensinⅡreceptor antagonist valsartan on intrarenal mRNA expressions of ETA and ETB in diabetic rats.Methods The experiment was carried out in one normal control group (C) and four groups of streptozotocin-induced diabetic Sprague-Dawley rats： untreated diabetic (D)， low dose treated diabetic (DV10)， high dose treated (DV50) and very high dose treated (DV100). The gene expression of ETA and ETB was determined by RT-PCR after 9 weeks.Results Compared to the normal control， the expressions of ETA and ETB genes were evidently increased in the diabetic rats (group D) (P&<0.01). The overexpression was reduced (improved) by high-dose valsartan (P&<0.01)， which was much better than what the low-dose one did， but the improvement was no further raised by increasing valsartan to the very high dose.Conclusion The renoprotective effect of valsartan of high dose is superior to that of low dose in diabetic rats. Valsartan may afford the renoprotection by decreasing the intrarenal expressions of ETA and ETB mRNA.
Key words： diabetic; valsartan; endothelin receptor
糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）是糖尿病的一种严重血管并发症，其发病机制复杂，与诸多因素有关。血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitor， ACEI）及血管紧张素受体阻断剂（angiotensin receptor blocker， ARB）已被作为DN临床治疗一线药物。Fujihara等［1］发现，传统剂量ARB不能完全阻滞肾脏过度激活的肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system， RAS），从而达不到完全肾脏保护作用。目前国内外文献多是ARB对糖尿病肾脏内皮素（endothelin， ET）水平影响的研究，缺乏ARB对糖尿病内皮素受体基因表达影响的研究。本研究目的在于观察缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏内皮素受体A（endothelin receptor A， ETA）、内皮素受体B（endothelin receptor B， ETB）基因表达的影响，进一步探讨ARB对糖尿病肾病的作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型制备、分组及处理 雄性SD大鼠50只，7 8周龄，体重180 220 g。链脲佐菌素（STZ） 65 mg /kg 经腹腔注入，48 72 h 后血糖≥16.7 mmol/L，确认为糖尿病模型成功。造模成功后模型鼠随机分成4组：①糖尿病组（D组），8只；②小剂量缬沙坦治疗组（DV10组），10只，缬沙坦10 mg·kg-1·d-1，灌胃；③大剂量缬沙坦治疗组（DV50组），10只，缬沙坦50 mg·kg-1·d-1， 灌胃；⑤极大剂量缬沙坦治疗组（DV100组），8只，100 mg·kg-1·d-1， 灌胃。设正常对照组（C组），8只。干预治疗至9周结束。动物空腹在3％水合氯醛麻醉下腹主动脉插管，接XY-1型血压监测仪记录平均动脉压，收集血标本；取肾，部分肾组织液氮保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 血糖测定 采用罗氏血糖仪测定尾静脉血糖。
1.2.2 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 总RNA的提取：取液氮保存的肾组织，一步法总RNA提取试剂盒提取RNA。逆转录：取肾组织总RNA 2 μg，按常规反应体系，于42℃反应50 min，92℃加热５ min，灭活MMLV。PCR反应：ETA引物，上游5′-CGAGGTCATGAGGCTTTTGG-3′，下游5′-GTGTTTAAGCTGTTGGCGGG-3′，扩增出的cDNA序列长度787 bp；ETB引物，上游5′-TGCACACCTTTCCGCAAGCACG-3′，下游5′-AGCTGGTGCCCTTCATACAGAAGGC-3′，cDNA序列长度919 bp；β-actin引物，上游5′-CAGAAGGACTCCTACGTG-3′，下游5′-GCTCGGTCAGGATCTTCATG-3′， cDNA序列长度442 bp。PCR反应条件设置：ETA 94℃ 5 min，94℃ 30 s、53℃ 45 s、72℃ 45 s（36个循环），72℃ 5 min；ETB 94℃ 3 min，94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃ 45 s（34个循环），72℃ 10 min。
扩增产物定量分析：扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，以凝胶成像系统对DNA扩增带进行图像分析，以ET受体/ β-actin的光密度值比值（D比值）表示ET受体基因表达水平。
1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件对数据分析处理，计量资料采用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析和秩和检验，组间两两比较采用q检验，P&<0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
各组糖尿病大鼠均出现明显多尿、血糖升高，干预治疗对这些指标无显著影响。与C组相比，平均动脉压、ETA、ETB表达在D组、DV10组增高（P&<0.01）；与DV10组相比，上述指标在DV50组下降(P&<0.01)；与DV50组相比，DV100组平均动脉压降低，其余指标无明显改变（P&>0.05）。具体见表1、图1。表1 各组大鼠观察指标比较
3 讨 论
DN是引起糖尿病患者死亡的主要原因之一。由胰岛素代谢障碍而导致的长期高血糖是DN发生的最关键原因，众多生长因子、细胞因子被激活则是病变形成的直接机制［2］，尤其是血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ， AngⅡ）与ET，它们在各种肾脏疾病包括DN 中起着重要病理作用。我们发现，缬沙坦治疗后不仅糖尿病大鼠肾组织AngⅡ含量下降，ET的含量亦下降，提示缬沙坦可能通过减少肾组织AngⅡ的生成来降低ET的含量［3］。
在DN发病机制中，目前认为氧化应激是重要的共同机制，AngⅡ能上调NADPH氧化酶的作用，其产物过氧化阴离子O-2与NO相互作用生成ONOO-，在DN肾损伤中起到重要作用，可导致肾小管基底膜增厚及间质纤维化［7］；而ETB受体分布于血管内皮细胞，可使一氧化氮释放，进而与过氧化阴离子O-2相互作用生成ONOO-造成肾损伤。
本试验中糖尿病大鼠肾脏ETA、ETB基因表达与正常大鼠相比明显增强，缬沙坦可降低糖尿病大鼠肾脏ETA、ETB基因表达，这可能为ARB保护肾脏的另一个重要作用机制；而且不同剂量缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏ETA及ETB基因表达影响不同，小剂量虽有一定疗效，但效果不如大剂量明显，剂量增至极大剂量，虽然平均动脉压进一步降低，但与大剂量相比效果无明显改善。
综上所述，缬沙坦可能通过降低肾内ETA、ETB表达而达到肾脏保护作用，而且此作用大剂量优于小剂量，但剂量增至一定程度后，效应不再增加。
【
参考文献
】［1］ Fujihara CK， Velho M， Malheiros DM， et al． An extremely high dose of losartan affords superior renoprotection in the remnant model［Ｊ］. Kidney Int， 2005，67(5):1913-1924.
［2］ 林善锬.糖尿病肾病［Ｊ］.中华内科杂志，2005，44(3):229-231.
［3］ 张广梅，尹忠诚，赵淑芹. 缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏AngⅡ、ET及TGF-β1的影响［Ｊ］.徐州医学院学报，2007，27(8):509-512.
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［7］ Ha H， Lee HB. Reactive oxygen species and matrix remodeling in diabetic kidney［Ｊ］. J Am Soc Nephrol ，2003，14(8 Suppl 3):S246-249.