【摘要】 目的 建立Walker-256大鼠种植瘤模型，探讨树突状细胞（DC）疫苗抑制肿瘤生长的机制。方法 从大鼠骨髓细胞中利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）在体外定向诱导分化出DC，液氮冻融法提取Walker-256肿瘤细胞抗原后刺激DC制备负载抗原的DC疫苗。ELISA法检测培养液中IL-12的浓度。雌性SD大鼠，皮下注射Walker-256肿瘤细胞制备种植瘤模型，成瘤大鼠按照体重配对，分为肿瘤治疗组和肿瘤对照组。10只体重分别相对应的雌性SD大鼠作为正常对照组。肿瘤治疗组大鼠皮下注射负载抗原的DC细胞悬液，肿瘤对照组和正常对照组大鼠皮下注射等量PBS。分别检测大鼠血IL-12浓度和肿瘤最大径。结果 得到大量具备典型光镜和电镜形态特征的DC，表达大鼠DC特异性标志OX62、OX6。负载抗原前后DC产生IL-12的水平存在明显差异（P＜0.05）。肿瘤治疗组大鼠肿瘤最大径显著小于肿瘤对照组（P＜0.01）。肿瘤对照组与正常对照组比较，IL-12明显下降（P＜0.05），肿瘤治疗组与肿瘤对照组比较，IL-12明显上升（P＜0.01）。肿瘤治疗组的肿瘤最大径与IL-12呈显著负相关（r=-0.826，P＜0.01）。结论 增强Th1介导的抗肿瘤细胞免疫可能是树突状细胞疫苗抑制肿瘤生长的机制之一。
【关键词】 Walker-256 树突状细胞 肿瘤疫苗 白细胞介素12
Inhibition of rat Walker-256 tumor growth by dendritic cell vaccine
WANG Jian1， YU Gang2， GUO Ji-qiang3， XU Gang2
(1.Department of General Surgery， the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College， Xuzhou，
Jiangsu 221006， China； 2.Grade 2004 of Postgraduate in General Surgery， Xuzhou Medical College，
Xuzhou， Jiangsu 221002；3.Central Clinical Laboratory， the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College)
Abstract： Objective To investigate the mechanism for dendritic cell (DC) vaccine to inhibit the growth of Walker-256 tumor in rats. Methods Soluble tumor antigen was prepared by running three freeze-thaw cycles of rat tumor cell line Walker-256. Anti-cancer DC vaccine was prepared by co-incubating the tumor antigen with the DC derived from rat bone marrow under the help of granulocyte／macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL-4). The level of IL-12 in culture medium was measred by ELISA. Female SD rats were injected Walker-256 tumor cells subcutaneously to form tumor models， which were paired on body weight and randomly pided into a treatment group and a tumor control group (n=10 each). Another 10 normal female SD rats were chosen to form the normal control group. DC vaccine（cell suspension of Walker-256 antigen sensitized DC）was injected subcutaneously to the treatment group， while an equal volume of PBS was administered to the rats in the tumor control and normal control groups. The blood level of IL-12 and the size (largest diameter) of tumor were observed. Results The tumor size was evidently smaller in treatment group than in tumor control group (P＜0.01). The level of IL-12 was significantly lower in tumor control group than in normal control group (P＜0.05)， but was markedly higher in treatment group than in tumor control group (P＜0.01). A negative correlation was revealed between IL-12 level and the largest diameter of tumor in the treatment group (r=-0.826， P&<0.01). Conclusion Enhancing the anti-tumorous cellular immunity mediated by Th1 cells could be one of the mechanisms for the DC vaccine to suppress tumor growth.
Key words： Walker-256； dendritic cell； tumor vaccine； IL-12
大量研究表明，肿瘤患者体内存在Th1细胞受抑制而Th3细胞占优势的现象，称为“Th1／Th3漂移”，且Th1／Th3的偏移与肿瘤的恶性程度呈正相关；与此同时，白细胞介素12（IL-12）的产生则逐渐减少，在患者出现远处转移或恶病质时，IL-12呈最低水平［1］。机体的抗肿瘤作用以Th1介导的细胞免疫为主，如果能够增强Th1型细胞免疫，将可能有效抑制肿瘤的发展。树突状细胞（DC）是惟一能激活未致敏T细胞并诱导其极化的抗原提呈细胞（APC）［2］，其激活后产生的IL-12则是Th1极化的启动因子［3］。据此，我们用SD大鼠和Walker-256肿瘤细胞株建立动物模型，探讨DC疫苗抑制肿瘤生长的机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物和细胞株 成年雄性SD大鼠，体重200 250 g；6 8周龄雌性SD大鼠，体重150 180 g，由徐州医学院实验动物中心提供。大鼠Walker-256肿瘤细胞株由南京中医药大学药理毒理实验室提供。
1.2 主要试剂 重组大鼠白细胞介素4（rrIL-4）、重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rrGM- CSF）、重组大鼠肿瘤坏死因子（rrTNF-α），美国Peprotech公司产品；胎牛血清，美国MD genics公司产品；大鼠淋巴细胞分离液，中科院生物工程医学研究所；Histostain-DC试剂盒，美国Zymed公司产品；大鼠IL-12p70 ELISA试剂盒，上海西唐生物科技有限公司进口分装。
1.3 DC体外实验
1.3.1 定向诱导大鼠DC 取健康雄性成年SD大鼠，断颈处死，浸入75％的乙醇中消毒10 min。无菌手术取出双侧股骨和胫骨，剥净肌肉组织，用无菌注射器抽取5 ml PBS，将针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓直至骨变白。密度梯度离心法获取髓单核细胞，细胞计数，每只大鼠可提取髓单核细胞（2.0 3.0）×107个。用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液重悬细胞，将细胞悬液接种于2只50 ml培养瓶中，每瓶10 ml，加入rrGM-CSF 10 μg／L 、rrIL-4 10 μg／L，置于37.0℃、5%CO2培养箱中培养。每2天半量换液，并按照rrGM-CSF 10 μg／L 、rrIL-4 10 μg／L补加细胞因子。
1.3.2 DC抗原的负载 定向诱导大鼠DC至第6天，换液补加细胞因子后，取出按1.4项步骤制备的抗原溶液，37.0℃水浴中融化，按照0.3 g／L的浓度加入培养瓶中，使每瓶抗原总含量为3 mg／瓶，并加入TNF-α 20 μg／L，第8天收获的细胞为负载Walker-256肿瘤细胞抗原的DC疫苗。
1.3.3 DC的鉴定 ①DC形态学鉴定：倒置显微镜观察培养第3天和第5天的DC生长特点；收集第8天的已添加抗原的DC，常规法制备样品，透射电镜观察树突状细胞。②histostain-DC免疫双染试剂盒检测大鼠DC表面标志OX62及OX6。
1.3.4 DC培养液中IL-12p70检测 反复4次提取大鼠髓单核细胞，体外培养诱导DC。收集每瓶细胞培养第6天（添加抗原前）和第8天（添加抗原）的培养液，ELISA法检测培养液中的IL-12p70浓度，作配对分析。
1.4 Walker-256肿瘤细胞抗原的制备 复苏Walker-256冻存细胞，用4 ml PBS重悬，注入4只健康雌性SD大鼠腹腔内（Walker-256传代鼠），每只1 ml，7天后可见腹腔积液形成。抽取腹腔积液10 ml，1000 r／min×10 min离心，弃上清，PBS 洗2次。用8 ml PBS重悬细胞，加入5 ml无菌冻存管中，每管4 ml，共2管，放入液氮中，10 min后取出冻存管，在室温下缓慢融化；待其完全融化后，再放入液氮中。反复3次。将冻存管中的液体分置入1.5 ml无菌EP管中，10000 r／min×30 min离心，收集上清，即为抗原溶液，测蛋白浓度9.33 g／L，将抗原溶液置入-80℃冰箱中冻存备用。
1.5 动物实验
1.5.1 Walker-256大鼠皮下种植瘤模型制备 选取25只雌性SD大鼠。抽取传代鼠腹腔积液14 ml，1000 r／min×10 min离心，弃上清，PBS洗2次，再用14 ml PBS重悬，注入上述25只大鼠左臀部外侧皮下，每只0.5 ml，10天后有20只大鼠形成皮下瘤。
1.5.2 分组及处理 肿瘤种植后第10天，将已形成皮下瘤的大鼠按照体重配对，共配成10对，分为肿瘤治疗组和肿瘤对照组；另外选取10只周龄、性别、体重分别相对应的正常大鼠作为正常对照组。于肿瘤种植后的第10天及第18天，收集负载抗原的树突状细胞，PBS洗2次，再用5 ml PBS重悬，注入肿瘤治疗组大鼠右侧腹股沟皮下，每只0.5 ml（含细胞3×105个）。肿瘤对照组及正常对照组皮下注射0.5 ml PBS。
1.5.3 大鼠瘤体及血IL-12p70的检测 ①分别在肿瘤种植后第10天、18天、25天，用游标卡尺测量肿瘤对照组和肿瘤治疗组皮下肿瘤的最大径。②于肿瘤种植后第25天，3组大鼠均由心脏抽血，分别置于15 ml离心管中，4℃过夜，于次日上午3000 r／min×10 min离心，获取血清，ELISA法检测大鼠血IL-12p70。
1.6 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件进行数据处理，数据以±s表示，应用t检验和方差分析，检验水准：α=0.05。
2 结 果
2.1 DC形态学观察
2.1.1 光镜观察 倒置显微镜下：培养1 3天的髓单核细胞贴壁生长，小而圆，少数细胞出现不规则形态；4 5天出现部分形态不规则的树突样细胞，伴有细胞突起，核不规则，同时还有少量贴壁的大而圆的巨噬细胞，悬浮于培养液中的则是小而圆的淋巴细胞（图1）；6天后树突样细胞大量增多。
图1 培养5天的髓单核细胞（×100）
2.1.2 电镜观察 透射电子显微镜下：培养到第8天的DC细胞形态不规则，细胞表面有数个大而长的突起，还有一些短小的圆形或椭圆形突起，细胞核也不规则，胞质有许多吞饮泡（图2）。
图2 培养8天的已负载抗原的DC（×5000）2.1.3 免疫检测 第8天的DC表现OX62和OX6阳性，OX62呈暗紫色，OX6呈猩红色。
2.2 DC培养液中IL-12p70检测结果 添加Walker-256肿瘤细胞抗原前后，DC产生IL-12p70的比较见表1。表1 DC培养液中IL-12p70含量
2.4 大鼠血IL-12p70检测结果 见表3。表3 3组血IL-12p70比较
2.6 肿瘤最大径与IL-12相关性分析 分别对肿瘤治疗组和肿瘤对照组的肿瘤最大径与IL-12进行相关性分析，发现肿瘤对照组的相关系数无统计学意义，肿瘤治疗组则显著相关（r=-0.826，P＜0.01）。
3 讨 论
DC起源于骨髓，其分化一般经过3个阶段：DC前体、未成熟DC和成熟DC［4］。未成熟DC的特征是很强的吞噬能力和共刺激分子如CD40、CD80、CD86的低表达［5］。吞噬抗原之后的DC逐步趋向成熟，这个过程伴随着多个方面的协调，如共刺激分子CD80和CD86的上调、吞噬性受体的丢失和MHC-Ⅱ的上调和变化［6］以及相关细胞因子的产生如IL-12［7］。IL-12是Th1极化的启动因子［3］，也是DC开始成熟的标志之一［8］。本实验中，我们用密度梯度离心法提取出大鼠骨髓DC前体细胞，用rrGM-CSF和rrIL-4加以诱导，获得未成熟DC。在培养第6天添加抗原供DC摄取，并加入TNF-α促进DC成熟，同时收集添加抗原前的和添加抗原后的第8天的培养液，这个过程反复了4次，然后用ELISA法检测其中的IL-12含量，并作前后配对分析，结果显示差异有统计学意义（P＜0.05）。说明大鼠DC在添加Walker-256肿瘤细胞抗原后已经开始成熟过程。
DC具有异质性，发生于淋巴和骨髓谱系。目前还没有一个统一的分类标准。根据诱导未致敏T细胞可分化为分泌不同细胞因子效应细胞，将它们分为诱导分化Th1的DC1和诱导分化Th3 的DC2。在人类［9］和小鼠［10］中，DC1表达髓系抗原，在体外可以用GM-CSF加以诱导，经微生物抗原刺激后产生IL-12；DC2缺乏髓系抗原，对GM-CSF无反应，但当IL-3存在时能被诱导，成熟后产生Ⅰ 型干扰素（IFN-α、β）。也就是说，在体外用GM-CSF只能诱导出DC1。提示我们培养的DC就是大鼠的DC1，而树突状细胞疫苗也就是负载Walker-256肿瘤细胞抗原的成熟DC1。
IL-12在Th1极化的过程中发挥关键性的作用，其虽然属于Th1类细胞因子，却不是由Th1细胞分泌，而是由抗原提呈细胞（APC）产生，其中主要是DC1［7］。肿瘤能够释放某些产物抑制DC1的分化成熟进而抑制IL-12的产生。肿瘤产生的PGE2［14］和IL-10［15］已经在很多肿瘤中发现。PGE2能诱导DC2分化，而抑制DC1［15］；IL-10则能抑制DC1的成熟［8］。肿瘤产物能诱导外周循环中的和浸润肿瘤的DC1自发性凋亡［16］。本实验结果显示，肿瘤对照组大鼠与正常对照组比较，IL-12水平明显降低（P＜0.05），而肿瘤治疗组大鼠在注射了DC疫苗（已经负载肿瘤抗原的成熟的DC1）之后，IL-12上升明显（与肿瘤对照组比较P＜0.01）。提示Walker-256肿瘤能够通过某种机制抑制大鼠体内DC1的分化和成熟。而肿瘤治疗组大鼠在输入树突状细胞疫苗之后，不仅能够产生特异性的免疫反应，并且能够通过某种机制诱导大鼠自身的DC1成熟，从而形成一种放大的效应。
对肿瘤对照组和肿瘤治疗组的肿瘤生长情况进行分析，结果显示在应用树突状细胞疫苗治疗前的第10天，2组肿瘤最大径比较差异无统计学意义，因此不能认为2组肿瘤最大径不等。随着治疗的进展，第18天和25天2组比较则显示差异有统计学意义（P＜0.01）。按照时间顺序对两组进行分析，结果显示肿瘤对照组大鼠的肿瘤最大径3个时点间的比较差异均无统计学意义，而肿瘤治疗组则除了第10天与第18天之间外，其余比较差异均有统计学意义。说明树突状细胞疫苗治疗荷瘤大鼠的疗效明显，与其他的研究结果一致［11 13］。
本实验中肿瘤治疗组的肿瘤最大径与IL-12存在相关性，提示IL-12介导的Th1型免疫反应对于抑制肿瘤生长具有重要意义。增强Th1介导的抗肿瘤细胞免疫可能是树突状细胞疫苗抑制肿瘤生长的机制之一。
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