作者：毛立军，郑骏年，李望，郑宏祥，刘俊杰，孙晓青，陈家存，温儒民
【关键词】 重组质粒
摘要 :目的 构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的RNA干扰（RNAi）表达载体。 方法 化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）启动子的下游，构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。 结果 经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。 结论 已成功构建pSliencer-hTERT载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。
关键词 :RNA干扰;短发夹RNA;人端粒酶转录酶;重组质粒;
Abstract:Objective To construct the expressing vector of small hairpin RNA（shRNA）targeting human telomerase re-verse transcriptase（hTERT）gene.Methods Two template DNA oligonucleotides for shRNA expression targeted hTERT gene were chemically synthesized.The annealed shRNA templates were processed to produce and identify the recombinant RNAi plas-mid sPilencer-hTERT.Results It was demonstrated that shRNA template targeting hTERT gene had been inserted at the ex-pected site and the insertion sequence was perfectly correct.Conclusion RNAi expression vector targeting hTERT gene has been constructed successfully and will be used as a useful method to develop specific hTERT-silencing therapeutics.
Key words:RNA interference;small hairpin RNAs;human telomerase reverse transcriptase;recombinant plasmid
端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒DNA得以延长使细胞永生。端粒酶逆转录酶（hTERT）是催化这一反应的惟一限速酶，因此有希望成为肿瘤治疗的理想靶点。RNA干扰是近年迅速发展起来的一项新的基因阻断技术，能特异、高效地阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具［1］。本实验将针对hTERT mRNA的小干扰RNA（siRNA）模板插入siRNA表达载体，构建载体hTERT-siRNA表达载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 pSilencer1.0-U6质粒为美国Am-bion公司产品，大肠杆菌JM109由徐州医学院生物化学教研室保存。T4DNA连接酶以及小量质粒提取试剂盒购自Promega公司，限制性内切酶BamHⅠ 和HindⅢ购自MBI公司。
1.2 实验方法
1.2.1 模板DNA合成 选择2段hTERT mRNA的序列作为RNA干扰的靶序列，序列一针对的是hTERT基因显性失活突变体区（NM003219:碱基序列位置2182-2200）。序列二采用Ambin公司的网上设计软件（www.ambion.com）进行设计，所对应的的靶序列为hTERT（NM003219:747-765）。设计2对编码短发夹RNA序列的DNA单链。序列一:P1:5′-CAAGGTGGATGTGACGGGCTTCAAGAGAGCCC-GTCACATCCACCTTGTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAA-AAAAGCCCGTCACATCCACCTTGTCTCTTGAACAAG-GTGGATGTGACGGGCGGCC-3′。序列二:P1:5′-GTCTGCCGTTGCCCAAGAGTTCAAGAGACTCTTGGG-CAACGGCAGACTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAAAAA-AGTCTGCCGTTGCCCAAGAGTCTCTTGAACTCTTGG-GCAACGGCAGACGGCC-3′。其顺序为ApaⅠ酶切位点、19nt正义序列、9nt loop接头序列、19nt反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子（6个T）、EcoRⅠ酶切位点。单链两端包含保护碱基和EcoRⅠ（AATT）以及ApaⅠ（GGCC）酶切残基，能直接与pSilencer1.0-U6siRNA线性表达载体连接。由Introvigen生物公司合成。
1.2.2 质粒pSilencer-hTERT表达载体的构建
1.2.2.1 寡核苷酸的退火 将合成的模板寡核苷酸溶解在100μl无核酶水中，取1μl用TE（10mmol.LTris，1mmol.L EDTA）稀释，使终浓度为1g.L。取正义模板链、反义模板链各2μl加入46μl的退火缓冲液，在90℃孵育3min，37℃孵育1h。退火后形成的双链用3%凝胶电泳，以10倍稀释的合成的单正链为对照，检测退火前后电泳图谱是否有变化。
1.2.2.2 寡核苷酸与pSilencer1.0-U6连接 将针对不同hTERT序列的2对退火后的模板链与pSi-lencer1.0-U6线性表达载体连接，重组后的载体命名为pSilencer-hTERT1、pSilencer-hTERT2。按下列操作进行:取5μl退火后的模板链用45μl无核酶水稀释成终浓度8mg.L，建立10μl反应体系:1μl上述稀释退火模板链、6μl无核酶水、1μl10×T4DNA连接酶缓冲液、1μl pSilencer1.0-U6、1μl T4DNA连接酶（5U.μl）。16℃孵育过夜。将重组载体转化感受态细胞JM109后提取质粒。
1.2.3 阳性克隆鉴定
1.2.3.1 酶切鉴定 用BamHⅠ或HindⅢ单酶切重组质粒，所有各管于37℃水浴过夜。取7μl样品在1%琼脂糖凝胶和TAE缓冲液中80V电泳0.5h观察结果。阳性克隆应该不能够被HindⅢ单酶切，但可被BamHⅠ切出大约370bp的小条带。
1.2.3.2 测序鉴定 将BamHⅠ和HindⅢ酶切后电泳出现大约370bp的阳性重组质粒送到上海英俊生物工程有限公司测序。
2 结果
2.1 退火寡核苷酸与单链寡核苷酸电泳结果 从电泳图（图1）可见，退火前后寡核苷酸电泳图谱明显不同。Lane1条带位置在100bp之前，约60bp左右。Lane2电泳图谱出现3条带，前面的2条与Lane4的2条带相似，前面的应该是单链寡核苷酸，后面的可能是2条单链的自身的连接，另一条带在100bp位置上，可能是单链自身折叠形成了发夹结 构，虽然分子量缩小，但由于发夹结构这种构象的改变，导致了电泳迁移速率放慢。Lane3与Lane1相似，而Lane4出现2条带，前面的应该是单链寡核苷酸，后面的可能是2条单链的自身的连接。从电泳图可见序列一的单链自身折叠以及2条单链的自身的连接程度比序列一明显得多。
图1 退火寡核苷酸与单链寡核酸电泳图（略）
1、2分别是序列一退火后、单链核苷酸;3、4分别是序列二退火后、单链核苷酸;M为marker
2.2 重组质粒酶切结果 将菌落扩增后提取质粒，酶切鉴定结果显示:2条序列构成的重组质粒都不能被HindⅢ单酶切，但可被BamHⅠ切出大约350bp大小的片段（图2）。
图2 重组质粒酶切电泳图（略）
1、2分别是序列一、二的重组质粒;3、4分别为HindⅢ酶切后重组质粒;5、6分别为BamHⅠ酶切后重组质粒
2.3 测序结果 由序列一构成的重组的阳性RNAi载体反复测序时信号都无法通过造成测序失败，由序列二构成的重组的阳性RNAi载体测序的结果，与我们设计合成的靶向hTERT的正义链完全一致，说明本实验已把合成的寡核苷酸插入到了RNAi载体pSilencer1.0-U6siRNA中，成功构建了能靶向端粒酶hTERT基因的pSilencer1.0-U6siRNA载体。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由于与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）引发的序列特异性转录后基因沉默过程，该技术已成为生物学研究进展最快的领域之一。最初是利用化学合成的siRNA实现RNAi，但siRNA作用时间短暂，进入细胞后很快被降解，24h后阻抑效果降低，作用持续时间约48h。为克服此缺陷，人们设想出利用载体介导siRNA体内表达技术，其原理是将siRNA对应的DNA模板插入载体中位于RNA聚合酶Ⅲ启动子下游，在RNA聚合酶Ⅲ作用下转录产生含发夹状结构的siRNA（shRNA）［2］ 。据此，Brummelkamp［3］ 设计出针对靶基因的siRNAs的模板DNA，将其与质粒连接后转染细胞，结果DNA模板在细胞内转录形成的shRNA具有与siRNA同样的抑制靶基因表达作用，更为重要的是这种作用可持续2个月。
siRNA序列的选择常遵循如下规则:其长度通常为19～21个碱基，一般从基因编码序列或cDNA序列的起始密码开始，向下游寻找腺苷二核苷酸（AA），标记并选择每个AA及其下游邻近的19个核苷酸序列一起作为siRNA的靶序列。在设计siR-NA的过程中，要避开cDNA的5′和3′非编码区（un-translated regions，UTRs）以及5′起始密码区附近50～100个核苷酸的序列，因为在这些区域含有丰富的蛋白结合位点，结合的调节蛋白以及形成的翻译起始复合物等可以影响siRNA与dsRNA诱导的沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC）结合到靶mRNA上［4］ 。所选择的siRNA序列必须进行全基因组扫描（BLAST）和序列同源分析。
本实验设计的siRNA模板序列顺序为:正义链 （19nt）―loop环区（TTCAAGAGA）―反义链（19nt）―RNA聚合酶Ⅲ终止子（TTTTTT）。所用载体为:当其插入pSilencer1.0-U6线性化质粒U6启动子下游后，在RNA聚合酶Ⅲ作用下转录产生含发夹状结构的siRNA，当转录至模板上的一连串T时转录终止。
本实验选择的序列二经酶切、测序鉴定证实成功构建了hTERT siRNA表达质粒pSliencer-hTERT。采用的序列一曾被Kosciolek等［5］ 作为靶序列化学合成siRNA，并且在肿瘤细胞中证明有效。本实验以此序列构建载体，酶切证实siRNA模板已插入载体，但在重组质粒测序的过程中，反复出现没有信号的现象，分析其原因可能是由于G.C含量过高，形成二级结构使测序信号无法通过造成的。在序列设计的过程中还要注意尽量避免G.C含量较高的序列，最好选择在40%～45%，G.C含量超过55%时的siRNA诱导的RNAi的效果较差。
参考文献
:［1］ Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic in-terference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans［J］.Na-ture，1998，391（6669）:806-811.
［2］ Sui G，Soohoo C，Affarel B，et al.A DNA vector-based RNAi techno.logy to suppress gene expression in mammalian cell［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（8）:5515-5520.
［3］ Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expres-sion of short interfering RNAs in mammalian cell［J］.Science，2002，296（5567）:550-553.
［4］ McManus MT，Sharp PA.Gene silencing in mammals bysmall interfer-ing RNAs［J］.Nat Rev Genet，2002，3（10）:737-747.
［5］ Kosciolek BA，Kalantidis K，Tabler M，et al.Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference［J］.Mol Cancer Ther，2003，3（2）:209-216.转贴于