【关键词】 宫颈癌
摘要 :目的 克隆宫颈癌MN.CA9抗原的多糖蛋白cDNA，并构建表达载体。 方法 从宫颈癌HeLa细胞中提取总RNA，RT-PCR法扩增MN.CA9抗原的多糖蛋白cDNA，将其插入载体pCA13，转化大肠杆菌JM109，构建MN.CA9抗原的多糖蛋白表达载体pCA13-MN。酶切及测序鉴定。 结果 酶切及序列分析结果证明，目的基因成功克隆入载体。 结论 成功构建了MN.CA9多糖蛋白表达载体。
关键词 :宫颈癌;MN.CA9抗原;多糖蛋白;基因克隆
Abstract:Objective To obtain the cDNA of proteoglycan protein of MN.CA9antigen of cervical cancer and construct the eukaryotic gene targeting vector pCA13-MN.Methods The total RNA was extracted from human cervical carcinoma cell line HeLa and the intact cDNA of proteoglycan protein was amplified by RT-PCR.The cDNA was cloned into pCA13vector and transformed into E.coli JM109.Results The result of sequencingwas completely consistentwith the published sequence of the proteoglycan protein cDNA.Conclusion The proteoglycan protein cDNA of MN.CA9antigen in human cervical cancer has been successfully cloned for preparing the tumor vaccine of MN.CA9antigen.
Key words:cervical cancer;MN.CA9antigen;proteoglycan protein;cDNA cloning
宫颈癌的发病率高居发展中国家女性恶性肿瘤的首位。放射治疗是宫颈癌主要治疗方法之一，但对于中、晚期患者疗效并不理想［1］ 。近年来，基础研究表明宫颈癌基因治疗具有应用前景，与放疗联合使用可显著提高进展期宫颈癌局部控制率，特别是对放射耐受的肿瘤［2］ 。针对肿瘤特异抗原蛋白或DNA的瘤苗，可以诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肿瘤的杀伤作用。宫颈癌抗原MN.CA9的发现，使利用瘤苗治疗宫颈癌成为可能。为此，构建MN.CA9的多糖蛋白cDNA表达质粒，以期为制备MN.CA9瘤苗治疗宫颈癌奠定基础。
1 材料和方法
1.1 主要材料 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、内切酶XhoⅠ、HindⅢ及T 4 DNA连接酶购自Promega公司;人宫颈癌HeLa细胞、大肠杆菌JM109、质粒pCA13由徐州医学院郑骏年教授惠赠。
1.2 总RNA提取 取HeLa细胞约1×10 5 个，按试剂盒说明提取总RNA。总RNA沉淀溶于100μl无核酶水中，-80℃保存。
1.3 RT-PCR 根据GenBank发表的MN.CA9cD-NA序列，设计引物，由Invitrogen公司合成。上游引物:5’-ATCCCCAAGCTTGCCCCCGGATGCA-GGAG-3’，引入HindⅢ酶切位点。下游引物:5’-CCAC-CGCTCGAGTGAAGC-GGCCCGCGCAG-3’，引入XhoⅠ酶切位点。加入总RNA20μg作为模板，上、下游引物至终浓度1μmol.L，用Promega公司的RT-PCR试剂盒进行反转录及PCR扩增。反应条件为:94℃30s，60℃1min，68℃2min，40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
1.4 cDNA的克隆及扩增 PCR扩增产物经酚-氯仿抽提纯化，HindⅢ和XhoⅠ双酶切及低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，酚-氯仿纯化。然后与经相同酶切后回收纯化的pCA13质粒室温连接5h，将连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，氨苄青平板筛选，37℃培养过夜。挑取单克隆阳性菌落，LB培养基中小量扩增，按Promega公司的试剂盒说明提取质粒，酶切鉴定。
1.5 序列分析 由上海基康生物技术有限公司进行测序。
2 结果
2.1 MN.CA9多糖蛋白RT-PCR产物分析 将RT-PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，可见一清晰360bp扩增条带（图1），其大小与理论预期值一致。
2.2 MN.CA9多糖蛋白cDNA克隆酶切鉴定 对阳性克隆提取质粒后行HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定，可见约6.9kb的载体片段及360bp的插入片段（图1）。
2.3 MN.CA9抗原多糖蛋白cDNA序列分析 对经酶切鉴定初步确认的阳性克隆测序。结果显示其序列与GenBank发表的宫颈癌MN.CA9抗原多糖蛋白cDNA序列完全一致（图2）。
1.pCA13-MN质粒双限制性酶切;2.pCA13质粒单限制性酶切;3.DNA Marker;4.RT-PCR扩增产物
图2 pCA13-MN质粒测序图（略）
3 讨论
1990年，Wolff等［3］ 首先报道用质粒DNA肌肉注射可使外源性基因在体内表达。随着研究的深入，发现该方式可有效诱导机体产生针对该DNA编码蛋白的特异性体液及细胞免疫应答，从此掀起了第3代疫苗即DNA疫苗研究的热潮［4-5］ 。
MN.CA9抗原是宫颈癌特异抗原，研究表明90%以上的宫颈癌高表达MN.CA9抗原，而正常的宫颈上皮不表达此抗原［6］ 。MN.CA9抗原是碳酸酐酶Ⅳ蛋白，是一种跨膜糖蛋白，由459个氨基酸构成，相对分子质量为54×10 3 或58×10 3 。其胞外区含有377个氨基酸（AA38～414），分为碳酸酐酶区和蛋白多糖区2个部分［7］ 。MN.CA9蛋白多糖区中的一些肽段可被淋巴细胞识别，诱导特异性免疫应答。如位于254～262位点的氨基酸组成的肽段可被CTL识别［8］ ，位于249～268位点的氨基酸肽段可被CD4（+）T细胞识别［9］ 。因此，蛋白多糖区cDNA或其表达蛋白可作为抗原刺激树突状细胞形成针对宫颈癌的瘤苗。
本实验以RT-PCR法从人宫颈癌HeLa细胞中获取MN.CA9多糖蛋白cDNA，酶切后克隆到表达载体pCA13中，经酶切及测序证实克隆成功。本研究的成功除可直接利用此质粒构建瘤苗外，还为利用其表达的MN.CA9多糖蛋白制备瘤苗奠定了基础。
〔感谢徐州医学院泌尿研究室郑骏年教授给予的大力帮助!〕
参考文献
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