作者：钱伟民，张中明，张伟，王彬
【关键词】 磷酸肌酸
摘要 :目的 观察外源性磷酸肌酸、左旋精氨酸对大鼠供心保存效果。 方法 40只健康SD大鼠随机分为4组，移植前供心保存480min，对照组:供心用4℃的St.Thomas液保存;1组:保存液中添加磷酸肌酸（CP）;2组:保存液中添加左旋精氨酸（L-arg）;3组:保存液中添加磷酸肌酸及左旋精氨酸。保存后进行颈部异位心脏移植术，并观察供心复跳情况。24h后处死受体动物，切除移植心脏，测心肌组织中ATP酶、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量，电镜观察心肌超微结构改变。 结果 实验组移植心脏自动复跳率高于对照组。3组心肌组织中ATP酶、SOD含量均高于对照组及1组、2组（P&<0.05），而MDA含量则低于对照组及1组、2组（P&<0.05）。心肌超微结构损伤较对照组与组1、组2轻。 结论 外源性磷酸肌酸、左旋精氨酸能明显增强保存液对心脏的保护作用。
关键词 :磷酸肌酸;左旋精氨酸;心脏移植;心脏保存;大鼠
Abstract:Objective To investigate the effects of creatine phosphate（CP）and L-arginine（L-arg）on the preserva-tion of donor heart in rats.Methods Forty rats were randomly allocated into4groups to get the hearts preserved for480min with4℃cardioplegic solution（control group），with cardioplegic solution plus CP（group1），with cardioplegic plus L-arg（group2）and with cardioplegic plus CP and L-arg（group3）.The donor heartwas transplanted into the neck of recipient rat.Left ventricular tissue was removed24h after transplantation to determine the contents of SOD，ATPase and MDA，and to study the myocardial ultrastructure.Results Arrhythmia was much less frequent in group3than in control group，group1and group2.The contents of SOD and ATPase were higher，but the content of MDA was lower in group3than in the other3groups.The damages in myocardial ultrastructure were also less severe in group3.Conclusion Exogenous CP and L-arg could signifi-cantly enhance the cardioplegia effects.
Key words:creatine phosphate;L-arginine;heart transplantation;heart preservation;rat
完善的供心保存是心脏移植成功的重要前提，目前供心的保存方法主要是低温和使用冷保存液。尽管现有的保存液种类较多，但至今仍无应用简单、长期保存效果优良的心脏保存液。本实验旨在通过改变保存液的成分来提高心脏保存效果，为临床应用提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 动物 SD大鼠40只，体重200～250g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 药品 磷酸肌酸（CP）、左旋精氨酸（L-arg）均由美国Sigma公司提供。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组 随机分为4组（n=10）。对照组:停搏液及保存液中均不含CP或L-arg;1组:供心停搏液及保存液中均含CP，CP浓度为10nmol.L;2组:供心停搏液及保存液中均含L-arg，其浓度为5.0g.L;3组:供心停搏液及保存液中均含CP及L-arg。另取40只体重相当的近交系Wister大鼠作为供心来源。
1.3.2 动物模型的建立 供、受体鼠均用10g.L的戊巴比妥钠按40mg.kg腹腔注射麻醉。
1.3.2.1 供体手术 供体大鼠麻醉后取仰卧位固定，乙醇消毒胸腹部后行正中切口，剪开胸腹部皮肤及皮下组织，显露下腔静脉注入肝素生理盐水5mg.kg。沿双侧腋前线开胸至锁骨，将整个胸前壁向上翻起，自膈下下腔静脉进针，快速注入5～6ml冷心脏停搏液，同时剪断下腔静脉放血。待心外膜变白、心脏停跳后，胸腔内置冰屑。靠近心脏处分别结扎、切断左、右上腔静脉及下腔静脉，切断左肺动脉及左主支气管，结扎、离断左肺静脉。切断右肺动脉和右主支气管，结扎并切断右肺静脉。切断降主动脉，提起近端，摘取心脏，放入4℃生理盐水修剪并牵引肺动脉通过套管后于St.Thomas液中保存480min。
1.3.2.2 受体手术 自胸骨上缘至下颌骨下方作颈部正中切口，显露右颈外静脉，在其第一个属支处结扎，切除右侧颌下腺和胸锁乳突肌。游离右侧颈总动脉，以动脉夹夹住近端，距颈内、外动脉0.5cm 处结扎、切断颈总动脉，近心端动脉用微型剪纵行剪开血管壁1mm，细尼龙线牵引颈总动脉通过套管，颈总动脉断端翻转于套管之外并结扎、固定备用。
1.3.2.3 心脏移植 供心移植于受体的右颈部，将供心的无名动脉套在备好的受体颈总动脉套管外并结扎、固定。纵行剪开右颈外静脉，将翻转好的供心肺动脉插入受体颈外静脉内，结扎、固定。剪去颈外静脉的远端和套管的延长部分。开放动脉夹，移植心脏迅速充盈、复跳。细丝线缝合切口。
1.4 观察指标
1.4.1 观察移植后心脏复跳情况。
1.4.2 超氧化物歧化酶（SOD）、ATP酶及丙二醛（MDA）含量的测定 移植24h后处死动物，取左心室肌，分别用二甲基亚砜化学发光法、生物发光法、荧光分光光度法测定心肌组织中SOD、ATP酶及MDA含量。
1.4.3 心肌超微结构观察 取2块不同部位左心室组织放入4%的戊二醛液中固定，按常规制作电镜切片，锇酸染色，H-7500透射电镜下观察心肌超微结构并摄片，放大倍数为35万倍。
1.5 统计学处理 实验数据用ˉx±s表示，采用t检验和F检验进行组间比较，P&<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 各组供心复跳情况 对照组有2例未自动复跳，出现心室纤颤，心脏按摩后转正常节律;实验组有3例未自动复跳，经心脏按摩后复跳，2例24h内出现期前收缩。
2.2 各组动物心肌组织中SOD、ATP酶、MDA含量比较 与对照组相比，实验组心肌组织中SOD、ATP酶含量明显增高，MDA含量降低（P&<0.05）。在实验组中，3组心肌组织中SOD、ATP酶含量高于1组、2组，而MDA含量则低于1组、2组。见表1。
2.3 心脏超微结构变化 对照组:线粒体排列紊乱，部分线粒体成空泡，肌丝不整齐、间隙增宽（图1）。1、2组病理改变较对照组为轻（图2、图3）。3组病理改变最轻，心肌细胞线粒体轻度肿胀，无嵴紊乱及消失现象，未见核膜、核仁明显改变（图4）。
表1 心肌组织中SOD、ATP酶、MDA含量比较（略）
图1 对照组心肌超微结构改变（锇酸染色，×35万）（略）
图2 实验1组心肌超微结构改变（锇酸染色，×35万）（略）
图3 实验2组心肌超微结构改变（锇酸染色，×35万）（略）
图4 实验3组心肌超微结构改变（锇酸染色，×35万） （略）
3 讨论
目前常用的心脏保存液可分为细胞内液型及细胞外液型。模仿细胞内离子环境的保存液被称为细胞内液型，相似于细胞外液离子浓度的保存液被称为细胞外液型。一些临床研究提示，细胞内液型保护液具有较好的心脏保存作用［1］ 。尽管低温和冷缺血延迟了细胞的死亡，但低温既降低了代谢又抑制了能量的产生，并且使得某些温度依赖性酶的活性降低，从而引起细胞肿胀。缺氧使无氧糖酵解过程被激活，产生大量乳酸，导致细胞酸中毒;而在血流和氧恢复的时候，心肌又会发生缺血.再灌注损伤。研究证实，黄嘌呤氧化酶和氧自由基产生的钙超载是再灌注损伤的内源性机制，此过程与缺血期ATP减少有关［2］ 。近年来，内皮功能的保存与心肌保护的关系受到关注。正常情况下，内皮能够合成一些具有松弛血管平滑肌的血管活性因子，如内皮依赖性一氧化氮（NO）、内皮依赖性超极化因子、前列腺环素、内皮素等。然而高钾成分的细胞内液对内皮细胞的功能和结构具有损害作用。
内源性CP的生物合成是由精氨酸和甘氨酸在肾合成开始，然后在肝甲基化形成肌酸，继而在各组织被磷酸化为CP。CP在高能量转换的细胞如心肌、骨骼肌等组织中含量较高，其分子中存在的高能磷酸键可在肌细胞内的各位点提供能量。心脏在冷缺血期间，心肌从有氧代谢变为无氧代谢，缺血使能量供应不足，高能磷酸盐耗竭，CP、ATP水平急剧下降。大量研究表明，外源性CP作为一种高效供能物质对心肌细胞在代谢和功能上具有保护作用。其作用机制可能为:①进入细胞并参与高能磷酸肌酸水平的维持;②抑制肌纤维膜5′-核苷酸酶从而维持高能磷酸水平;③抑制溶血脂酶的聚集;④保护心肌免受过氧化损害［3］ 。
L-arg则是NO的生理性前体物质，经NO合成酶（NOS）作用后生成NO。心肌缺血.再灌注损伤时L-arg缺失，心肌内NOS活性降低，缺血.再灌注心肌产生的氧自由基等物质可抑制NO生成并使其灭活，终致内源性NO基础释放减少或衰竭，导致心肌顿抑、心律失常。外源性L-arg可通过L-arg-NO通路促使NO生成增加。已有实验表明，NO具有心肌保护作用，这种作用可能与NO扩张局部血管、阻止血小板凝聚、减少淋巴细胞及中性粒细胞黏附于血管内皮细胞、升高心肌cGMP及中和或直接清除氧自由基有关［4］ 。
因此，从理论的角度来看，在供心保存液中加入上述2种物质以减轻供心冷缺血期间能量的缺失以及再灌注所带来的心肌损害应是可行的。
本实验结果提示，在心脏停搏液及保存液中加入CP、L-arg的实验组动物，其心肌组织中SOD、ATP酶含量较仅加入CP或L-arg的动物为高，而MDA含量则较低。这表明两者具有协同作用。作用的机制可能为，CP能减轻Ca 2+ 超载，阻断了黄嘌呤氧化途径，减少了缺血.再灌注损伤所诱发的心率失常及心肌超微结构损伤;而L-arg则通过NO途径使局部血管扩张，抑制中性粒细胞的黏附，从而减轻心肌冷缺血期间及心肌再灌注损伤。
参考文献
:［1］ Toshima Y，Matsuzaki K，Mitani A，et al.The myocardial recovery mode after cold storage for transplantation with Collins′solution and cardioplegic solution［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，1992，104（5）:1320-1328.
［2］ 藏旺福，夏求明.移植心脏的保存［J］.哈尔滨医科大学学报，2002，36（3）:251-252.
［3］ Robinson LA，Brainbridge MV，Hearse DJ.Creatine phosphate:an additive myocardial protective and antiarrhythmic agent in cardiplegia［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，1984，87（2）:190-200.
［4］ Desrois M，Sciaky M，Lan C，et al.L-arginine during long-term ischemia:effects on cardiac function，energetic metabolism and endo-thelial damage［J］.J Heart Lung Transplant，2000，19（4）:367-376.转贴于