中药治疗后MMP9、TIMP1及CA125异位和在位子宫内膜中的表达

【摘要】 目的 探讨中医药治疗子宫腺肌症的作用机制。方法 37例行全子宫切除术的子宫腺肌症患者术前分为中药治疗组(n=17)和对照组(n=20)。子宫内膜作为在位内膜标本，腺肌瘤作为异位内膜标本。采用免疫组化法测定并比较在位和异位内膜中基质金属蛋白酶9(MMP9)和组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)的表达水平，并观察两组患者治疗前、后血清CA125的变化。结果 中药治疗组异位内膜组织中，MMP9在腺上皮细胞内的表达显著低于对照组(P<0.05)，TIMP1的表达显著高于对照组(P<0.05)，MMP9/TIMP1比值显著低于对照组(P<0.05)。中药组治疗后血清CA125 明显降低，与治疗前及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 中药可能通过下调MMP9/TIMP1的比值及降低血清CA125水平来控制异位内膜组织的种植侵袭。

【关键词】 中医药；子宫腺肌症；基质金属蛋白酶9；组织金属蛋白酶抑制剂1；CA125

　　ABSTRACT: Objective To study the mechanism of Chinese Medicine in treating adenomyosis. Methods Thirtyseven patients in the Chinese Medicine treated group (17 cases of adenomyosis) and the control group (20 cases of adenomyosis， nondrug treated) underwent hysterectomy. Endometrium was looked as eutopic endometrium and adenomyosis as ectopic endometrium. Expression of MMP9 and TIMP1 in eutopic and ectopic endometrium were measured by immunohistochemical techniques. Meanwhile the levels of CA125 in serum were measured. Results The ectopic endometrium of the Chinese Medicine treated group expressed lower level of MMP9， higher level of TIMP1 and lower ratio of MMP9/TIMP1 than the ectopic endometrium of the control group (P<0.05). The levels of CA125 in serum were significantly decreased in Chinese Medicine group after treated as contrast with those in control group. Conclusion Chinese Medicine could reduce the level of CA125 and the ratio of MMP9 and TIMP1 to prevent the progression of adenomyosis.

　　KEY WORDS: Chinese Medicine; adenomyosis; matrix metalloproteinases9; tissue inhibitors of metalloproteinases1; CA125

　　子宫腺肌症是妇科常见病、多发病，由具有生长能力的子宫内膜腺体及间质侵入子宫肌层所致。细胞侵袭必须降解细胞外基质(extracellular matrix， ECM)屏障，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)家族是这一过程中的重要酶类，组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases， TIMPs)是MMPs的天然抑制物。MMPs和TIMPs除与肿瘤的侵袭和转移密切相关外，也与子宫内膜异位性疾病的病程演进密切相关。目前，临床上常采用活血化瘀、益气补肾的中药治疗子宫腺肌病症，疗效较佳。本实验通过免疫组化方法，观察中药治疗后MMP9和TIMP1在子宫腺肌症组织(异位子宫内膜)和在位子宫内膜中的表达，以及治疗前、后血清CA125水平的变化，探讨中药治疗子宫腺肌症的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　选择2007年1月至2008年4月在我院门诊就诊的子宫腺肌病患者61例，按就诊次序随机分为中药治疗组和对照组。中药治疗组(n=31)，使用活血化瘀、益气补肾的中药治疗3个月；对照组(n=30)，未使用任何药物治疗。所有患者均为绝经前妇女，无糖尿病、肾脏疾病、血液系统等重要器官疾病史；就诊前6个月无任何激素(包括雌激素、肾上腺皮质激素、避孕药等)使用史。疗效参照有关文献拟定[1]：痊愈：痛经症状全部消失，子宫恢复正常大小；显效：痛经症状消失，子宫较前缩小；有效：痛经症状减轻，重度变为中度或轻度，子宫大小无变化；无效：痛经症状及子宫大小无变化。中药治疗组治愈9例，显效12例，有效12例，无效5例。患者中行全子宫切除术者17例，平均年龄(48.71±4.35)岁；对照组行全子宫切除术20例，平均年龄(47.03±3.37)岁。取子宫内膜作为在位内膜标本，腺肌瘤作为异位内膜标本，所有标本均经病理证实。

　　1.2 诊断标准

　　参照卫生部制定的《中药(新药)临床研究指导原则》[23]中盆腔子宫内膜异位症的诊断标准，根据临床表现、妇科检查、B超检查、临床诊断后确定为子宫腺肌症。

　　1.3 治疗方法

　　中药治疗组服活血化瘀、益气补肾中药，方药组成：桃仁10g、红花8g、玄参15g、当归10g、川芎10g、丹参15g、僵蚕10g、香附10g、巴戟天10g、淫羊藿15g、菟丝子10g、川断15g、黄芪20g。1次/日，2日1剂，连用3个月。

　　1.4 标本采集

　　术中收集子宫在位和异位内膜组织，常规100mL/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，5μm厚切片，HE染色后，光镜下观察组织切片，包括腺上皮细胞和基质细胞。

　　1.5 免疫组化SABC法

　　采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连接法。用低倍和高倍镜观察切片，阳性细胞为镜下结构清晰的组织细胞，细胞质内有棕黄色颗粒沉着，染色明显高于背景。采用Axioplan 2 imaging显微图像分析系统对子宫内膜组织的腺上皮细胞的MMP9和TIMP1表达分别进行半定量测定。阳性细胞胞质或胞核呈黄色。按染色强度及阳性细胞数分别评分0～3分。染色强度：阴性(0分)，淡黄色为弱阳性(1分)，深棕黄色为强阳性(3分)，中度阳性介于弱阳性与强阳性之间(2分)；阳性细胞数≤15%(1分)，≤25%(2分)，≤50%(3分)，≤75%(4分)，≥75%(5分)。表达强度用组织学评分(Σpi)表示，其中i代表染色强度(强阳性率)；p代表同一染色强度细胞所占计数细胞百分比(阳性率)。每张切片随机选取3个视野(400倍)，取组织学评分平均值作为结果。组织学评分由2位专业实验室人员审核。

　　两组治疗前、后皆于月经干净后5d内，分别抽取空腹静脉血检测血清CA125。血清CA125测定采用MODULARANAL YTICS E170型测定仪。

　　1.6 统计学分析

　　采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。数据以±s表示，组间比较行独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MMP9和TIMP1在异位和在位子宫内膜中的表达

　　各组标本在位和异位内膜腺上皮细胞和基质细胞MMP9和TIMP1均有不同程度的表达，尤以腺上皮细胞为主，细胞质内可见棕黄色物质沉着。异位内膜组织中，中药治疗组MMP9在腺上皮细胞内的表达显著低于对照组(P<0.05)，TIMP1的表达显著高于对照组(P<0.05)；在位内膜组织中，中药治疗组MMP9在腺上皮细胞内的表达与对照组比较无统计学差异，而TIMP1的表达则显著高于对照组(P<0.05)。对照组异位内膜组织中，MMP9、TIMP1在腺上皮细胞内的表达显著高于在位内膜组织(P<0.05)。中药治疗组异位内膜组织中，MMP9和TIMP1在腺上皮细胞内的表达与在位内膜组织无统计学差异(P>0.05，表1)。表1 MMP9和TIMP1在异位和在位子宫内膜中的表达（略）

　　2.2 MMP9和TIMP1的比值

　　中药治疗组异位内膜的腺上皮细胞内MMP9/TIMP1<1.0；对照组异位内膜的腺上皮细胞内MMP9/TIMP1>1.0，两组差异有统计学意义(P<0.05)。中药治疗组在位内膜的腺上皮细胞内MMP9/TIMP1<1.0，对照组在位内膜的腺上皮细胞内MMP9/TIMP1>1.0，两组差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 两组患者治疗前、后血清CA125的变化

　　中药治疗组治疗前血清CA125水平为(38.01±26.35)ρ/(U·mL)，对照组血清CA125水平为(37.71±25.21)ρ/(U·mL)，两者比较无统计学差异(P>0.05)，治疗后中药组患者血清CA125水平为(22.34±13.78)ρ/(U·mL)，较治疗前明显降低，与对照组比较亦有统计学差异(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　3.1 MMPs和TIMPs的生物学特性

　　MMPs属于高度同源性的锌离子依赖性内肽酶，产生于正常组织细胞和肿瘤细胞中，以前酶形式分泌，目前发现在人类至少有23种之多[4]。在正常组织中MMPs表达量极少，而在炎症细胞因子、激素、生长因子刺激下的细胞转化过程中，表达量上升，其涉及人体多种生理和病理过程，如炎症、胚胎发生、血管形成、肿瘤侵袭转移等。MMPs的肽链含有2个Zn2 +和2个Ca2+，它可以从底物肽链中间起裂解作用，是ECM降解过程中必不可少的酶。构成ECM的Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白等成分均为MMPs的作用底物，能被MMPs降解，特别是MMP2和MMP9能够特异性地降解基底膜的主要成分-Ⅳ型胶原[5]。
　　
　　TIMPs作为MMPs的天然抑制剂，是一组能抑制MMPs活性的多功能因子家族，是体内细胞分泌的一类蛋白酶抑制剂，在肿瘤组织和间质细胞中均可表达。迄今发现有4种，常由分泌MMPs的同一细胞合成，其与活化状态MMPs结合稳定且不可逆。TIMPs是一种糖蛋白，它可与活化的MMP2、MMP9形成1∶1的复合体而抑制其活性，降低ECM的降解[5]。SANG[6]的研究表明，MMP1、MMP2、MMP9在分解胞外基底膜的同时，还启动血管生成，这一作用可被TIMPs抑制。肿瘤细胞与其所依赖的细胞外间质之间的相互作用，导致ECM代谢平衡失调，从而引发细胞的侵袭转移。这一代谢的失衡表现为对ECM有效成分降解的增强。研究表明，侵袭转移表型的细胞均高表达MMPs、MMP2、MMP9和TIMP1，与肿瘤发生过程和恶性预后相关[6]。

　　3.2 中药对MMPs和TIMPs在子宫内膜异位性疾病中表达的影响
　　研究表明，MMPs与子宫内膜异位性疾病的发生有关。MMPs的增加能明显加强降解细胞外基底膜IV型胶原的能力，使细胞基底膜完整性受到破坏，促进内膜细胞转移，促成了异位内膜的形成和生长；异位内膜中的MMP3的过度表达，使异位内膜侵犯ECM致降解ECM成分的蛋白酶的活性增加，能够降解异位内膜细胞周围基底膜与其他ECM成分，病灶向间质浸润，使EMs的内膜组织比正常内膜组织更易发生侵袭与种植。同时TIMPs降低，不能发挥阻抑MMPs的作用，两者比例失衡，加速细胞外基质降解、细胞转移的过程。同时，子宫内膜之所以能成功地异位种植生长，与局部新生毛细血管的形成有关。TIMPs能通过抑制血管生成素诱导血管内皮细胞出芽，阻碍MMPs介导的内皮细胞移动，抑制基质中促血管生成因子的释放，抑制血管发生[6]。在异位内膜形成过程中，TIMPs还具有调节细胞黏附的作用，抑制异位内膜的种植和生长。已有体外动物实验证实，TIMP1可有效地减少异位内膜的侵袭生长。TIMP1蛋白在EMs异位内膜和在位内膜组织的腺上皮和间质中的明显降低，对MMP3的抑制减弱，导致MMP3/TIMP1比值增高，使得异位内膜和在位内膜具有较高的侵袭力，导致腹腔种植以及异位病灶的发展。在EMs的异位组织中，MMP3/TIMP1之间的平衡失调与增强异位内膜的侵袭与种植有明显的相关性[7]。
　　
　　子宫腺肌症属中医“痛经”及“月经前后诸证”的范畴，主要表现为继发性进行性痛经、月经失调、子宫均匀增大等。子宫腺肌症以少腹疼痛为主，病位在胞宫、冲任，变化在气血，为血瘀实证。瘀血内阻，气机不畅，津液运行迟滞，易聚湿为痰，瘀阻胞宫、冲任，不通则痛。血瘀、气滞、痰湿之间互为影响，终致胶结不解，瘀结日久而本病。病情缠绵难愈，耗伤正气，气虚运血无力，又可进一步加重血瘀。故治疗以活血化瘀、消症止痛为主，兼顾益气扶正[8]。活血化瘀药能够起到活血调经、消症散结之效，使患者疼痛减轻。而本症患者在痛经时常伴有不同程度的腰酸腿软、神疲乏力、怕冷、夜尿、耳鸣、头昏等肾虚症状，经补肾药物治疗后精神好转，体力增强，肾虚症状均有改善。由此可见，肾虚是本病发病的内在原因，是本；瘀血内阻，则是标，所以治疗上在活血祛瘀解除患者疾病的同时，益气补肾而治本。丹参、桃仁活血祛瘀；玄参益阴软坚化积；川芎、当归、红花活血、行气止痛，香附调经理；黄芪补气扶正以助血行气止痛，僵蚕息风止痉、祛风止痛；巴戟天、淫羊藿、菟丝子、川断补肾助阳。本实验结果显示，在中药治疗组和对照组的异位和在位内膜腺上皮细胞和基质细胞内MMP9和TIMP1均有表达，以腺上皮细胞细胞质内表达为主。子宫腺肌症异位内膜细胞中MMPs高表达与TIMPs低表达，使得MMPs与TIMPs之间的比例失衡(即MMP9/TIMP1>1)，使ECM降解，基底膜消失，从而引发异位内膜细胞在子宫腔以外的部位黏附、侵袭、生长，并促进局部血管生成而形成异位病灶。经过活血化瘀、益气补肾中药治疗后，异位内膜组织中MMP9相对下降，而TIMP1相对上升，MMP9/TIMP1的比例失调得到纠正，阻止了ECM降解，从而抑制异位病灶形成，可达到治疗子宫腺肌症的目的。

　　3.3 中药对血清CA125的影响

　　子宫腺肌症患者血清CA125增高是由肌间异位的子宫内膜分泌所致，异位的子宫内膜有较强的分泌CA125功能，通常是正常子宫内膜的2～4倍。近年来研究发现，它与子宫内膜异位症和子宫腺肌病有关[910]。本研究结果表明，两组患者治疗前血清CA125水平无显著性差异(P>0.05)，治疗后中药组患者血清CA125水平明显降低，均较治疗前及对照组有显著性差异(P<0.05)，表明中药组能明显降低患者体内血清CA125水平，为活血化瘀、益气补肾中药治疗子宫腺肌病的有效性提供了客观依据。
　　
　　总之，中药治疗能显著降低血清CA125 水平，其可能通过下调MMP9/TIMP1的比值来控制异位内膜的种植侵袭，阻止ECM降解和局部血管生成。

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