高效液相色谱法测定早期肾移植患者麦考酚酸的血药浓度

　　　　 作者：董卫华，董亚琳，郑鑫，尤海生

【摘要】 　　目的 建立高效液相色谱法测定人血浆中麦考酚酸浓度的简便方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为C18柱(3.9mm×300mm)，以40mmoL/L四丁基溴化铵乙腈[55∶45(V∶V)，H3PO4调pH=4]为流动相，流速0.8mL/min，紫外检测波长254nm，用甲醇沉淀蛋白法进行血样处理。结果 麦考酚酸的线性范围为0.8～51.54mg/L(r=0.9998)，平均相对回收率95.5%～109.2%，提取回收率>90%，批内和批间RSD<10%。结论 本方法准确、简便，可用于麦考酚酸的血药浓度监测和生物等效性研究。

【关键词】 肾移植；麦考酚吗乙酯；麦考酚酸；高效液相色谱法(HPLC)；血药浓度

　　ABSTRACT: Objective To establish a highperformance liquid chromatography method for determination of mycophenolic acid in human plasma. Methods The method was performed with C18 column (3.9mm×300mm). The mobile phase consisted of 40mmoL/L TBA solutionacetonitrile adjusted to pH 4 with orthophosphoric acid (55∶45， V∶V)， with a flow rate 0.8mL/min. The UV detection wavelength was 254nm. Plasma samples were extracted with methanol. Results The linear concentration of the calibration curve ranged from 0.8 to 51.45mg/L (r=0.9998). The relative recoveries were between 95.5% and 109.2%， and the extraction recoveries were more than 90%. Relative standard deviation (RSD) of intraday and interday assays were both less than 10%. Conclusion The method is proved to be reliable and simple for monitoring mycophenolic acid in human plasma and bioequivalence research.

　　KEY WORDS: renal transplantation; mycophenolate mofetil; mycophenolic acid; highperformance liquid chromatography (HPLC); blood concentration

　　麦考酚吗乙酯(mycophenolate mofetil， MMF)是新型免疫抑制剂，为前体药物，口服或注射后迅速在体内水解转化为活性代谢物麦考酚酸(mycophenolic acid， MPA)，通过非竞争性抑制嘌呤合成途径中次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的活性，抑制T、B淋巴细胞的增殖反应，发挥免疫抑制作用，临床用于预防和治疗肾、肝、心脏及骨髓移植的排异反应。MMF在血浆中几乎无法检测，而MPA浓度高可以检测到，所以MMF的药代动力学特点实际由MPA在体内的代谢过程来反映[1]。以前认为，MMF治疗窗宽、药物代谢稳定、个体差异小、不需监测血药浓度，但随着其在临床上广泛应用，发现器官移植患者MPA血药浓度水平与排斥反应发生率有很强的相关性[2]，且与MMF相关的不良反应如胃肠功能失调、白细胞减少症及相关感染、恶变的发生率呈升高趋势，所以监测移植患者MPA血药浓度，制订个体化给药方案，对于指导MMF的安全有效用药具有重要意义。基于此，我们建立了一种简便、快速测定MPA浓度的高效液相色谱(high performance liquid chromatography， HPLC)法，可用于常规血药浓度的监测。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　仪器：美国Waters高效液相色谱仪，包括510型恒流泵、486型可调波长UV检测器、7725I型进样阀、AS938色谱工作站；AllegraTM×22R高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司生产；SK1快速混匀器，江苏金坛国华仪器厂。试剂和药品：麦考酚吗乙酯片(骁悉，瑞士巴塞尔豪夫迈·罗氏制药有限公司制造，上海罗氏制药有限公司分装)；麦考酚酸对照品(批号EC No.2461193，含量99.02%，上海罗氏制药有限公司提供)；四丁基溴化铵(TBA)，分析纯，天津市博迪化工有限公司生产；乙腈、甲醇为色谱纯，美国Fishers公司生产；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。血样由我院肾移植科提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 色谱条件

　　色谱柱：Waters μBondapak C18柱(3.9mm×300mm，10μm)；流动相：40mmoL/L TBA乙腈=55∶45(V∶V)，0.5mol/L H3PO4调pH=4；温度：室温；流速：0.8mL/min；紫外检测波长：254nm；检测灵敏度：0.01AUFS。

　　1.2.2 样品预处理方法

　　取血浆样品0.3mL，置于1.5mL具塞塑料离心管中，加入0.5mL甲醇，涡旋震荡1min，4℃ 13000r/min离心22min，取上清液50μL进样。

　　1.2.3 对照品溶液的配制

　　精密称取MPA对照品13.4mg，置10mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1.34g/L的对照品贮备液。精密吸取MPA对照品贮备液，用甲醇稀释配成不同浓度的MPA对照品溶液系列，置4℃冰箱保存备用。

　　2 结 果

　　2.1 专属性和选择性

　　在本实验条件下，MPA能够与MMF的体内代谢物以及血浆中内源性物质实现较好分离，肾移植术后其他常用免疫抑制剂如环孢素、它克莫司、甲基强的松龙、硫唑嘌呤对测定没有干扰。色谱图见图1，MPA保留时间约为10.36min。

　　2.2 标准曲线

　　取空白人血浆0.3mL，分别加入MPA对照品溶液适量，精密配成质量浓度为0.80、1.61、3.22、6.44、12.88、25.77、51.54mg/L的对照品血浆，按“样品预处理方法”操作，以MPA峰面积A为横坐标，MPA浓度C为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。结果表明，MPA质量浓度在0.8～51.54mg/L范围内有良好线性关系，最低检测质量浓度为0.8mg/L，回归方程为：A=28212.39C-2056.60(n=7，r=0.9998)。

　　2.3 回收率

　　于空白人血浆中准确加入定量的MPA对照品溶液，配成质量浓度为1.06、6.00、30.13mg/L的对照品血浆，按“样品预处理方法”操作，以血浆中MPA峰面积与相应浓度对照品溶液进样测得峰面积之比求算绝对回收率，以利用标准曲线测得的对照品血浆浓度与配制浓度的比值计算方法回收率。结果符合体内药物分析要求(表1)。

　　2.4 精密度

　　配制质量浓度为1.06、6.00、30.13mg/L的对照品血浆若干份，于同一日内按“样品预处理方法”平行操作5次，根据测定结果计算日内RSD，另在连续5日内，每日5次平行操作，根据测定结果计算日间RSD。结果日间、日内精密度均符合体内药物分析要求(即RSD<10%，表1)。表1 血浆中MPA浓度测定的精密度与回收率（略）

　　2.5 稳定性试验

　　分别将MPA血浆标准液在室温条件下存放24h、在-20℃放置3个月、冻融，以及血样处理后室温放置24h，测定MPA含量。结果各种条件下MPA都保持稳定(表2)。表2 不同保存条件下MPA血浆样品的稳定性（略）

　　2.6 患者血药浓度的测定结果

　　全部血样由我院肾移植科提供，患者为肾移植术后3d、10d、4周的患者，均采用环孢素+MMF+强的松三联免疫抑制治疗方案。用有限采样法，于服药前、服药后0.5、2h采静脉血，按2.2项下测定其浓度，并根据文献公式[3]，计算曲线下面积，MPAAUC0-12h=11.34+3.1C0+1.102C0.5+1.909C2(C0：用药前浓度；C0.5：用药后0.5h浓度；C2：用药后2h浓度)，共测定30例。结果肾移植术后早期AUC0-12h均值在30～60mg/(h·L)之间(表3)。表3 早期肾移植患者服用MMF后MPA的血药浓度（略）

　　3 讨 论

有关测定血浆中MPA的HPLC方法，文献报道大多血样处理复杂，难以进行常规血药浓度监测。本法血样处理简单，方法稳定，为医院常规血药浓度监测提供了选择。作者曾对流动相的pH值反复在2.7～7.2之间实验，发现pH为4时出峰最优；并试用与甲醇等量的乙腈沉淀蛋白，效果亦较好，但相比之下，用甲醇沉淀蛋白使提取回收率更高。

本实验因血样前处理简单，无萃取、浓集等过程，标准曲线与样品测定时的条件易平行一致，故直接选用外标法定量。

MPA的血浆浓度时间曲线下面积与药物治疗的临床效果密切相关。单一时间点的血MPA浓度与MPA曲线下面积AUC0-12h的相关性不理想[4]，故在临床常规开展血MMF/MPA单点浓度监测意义不大。而常规药代动力学测定需要在短时间内采集多次血样，患者难以忍受，因此国内外学者提出了有限采样法。该法采集患者3～4个时间点的血样，通过公式计算AUC，越来越被认同，其中，包括C8(用药后8h浓度)在内的采样法，预测效果最理想[5]。C1(用药后1h浓度)、C2.5(用药后2.5h浓度)、C8三个试点采样受到推荐，其估算的AUC值与标准AUC值的相关性R2可达0.906[6]。文献报道肾移植术后早期合适的AUC0-12h治疗窗为30～60mg/(h·L)之间[2]，本研究血样采用C0、C0.5、C2三个试点，得出的AUC值与文献报道治疗窗一致。

参考文献

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　　[3]WANG CX， MENG FH， CHEN LZ， et al. Population pharmacokinetics of mycophenolic acid in senile Chinese kidney transplant recipients [J]. Transpl Proc， 2007， 39(5):13921395.

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