EDFS40对深低温保存兔颈总动脉结构和舒缩功能的影响

　　　　 作者：蒋安，刘峰，刘昌，宋宇龙，孟珂伟，吕毅蒋安

【摘要】 目的 评价玻璃化溶液EDFS40对深低温保存兔颈总动脉形态结构和舒缩功能的影响。方法 无菌条件下取兔颈总动脉，分别以EDFS40和1.5mol/L二甲亚砜为低温保护剂，经玻璃化法和慢速冷冻法深低温保存14d。复温后和新鲜动脉进行大体和显微形态的观察，器官浴槽内进行非内皮依赖性舒缩功能的测定。结果 EDFS40组动脉的大体、组织学及超微结构与新鲜动脉相似，对氯化钾的收缩力和慢速冷冻组动脉无明显差别(P>0.05)，对去甲肾上腺素和硝普钠的收缩或舒张张力优于后者(P<0.05)，但均低于新鲜动脉(P<0.05)。结论 EDFS40能较好保持兔颈总动脉的形态结构及功能，可用于血管的玻璃化保存。

【关键词】 深低温保存；兔；颈总动脉；EDFS40；玻璃化

　　ABSTRACT: Objective To assess the effect of EDFS40 on the structure and vasomotoricity of rabbit carotids in cryopreservation. Methods The fresh carotids， taken from rabbits under aseptic conditions， were preserved for 14 days in liquid nitrogen by vitrification or slow freezing method with EDFS40 or dimethyl sulfoxide (1.5mol/L). The morphological changes of both fresh and thawed carotids were observed by visual examination， optical and electron microscopes， respectively. Their endotheliumindependent vasoconstriction and vasodilatation were detected in organ bath. Results The morphological changes of the EDFS40vitrified arteries were similar to those of the fresh carotids under macrography， optical and electron microscopes. And there was no obvious difference in contraction to KCl between the cryopreservation group and the slowfreezing group (P>0.05). The contractile and relaxant responses of vitrified arteries to NE or SNP were significantly better than those of the frozen arteries (P<0.05); both， however， were still inferior to the vasomotoricity of the fresh arteries (P<0.05). Conclusion The rabbit carotids vitrified with EDFS40 can have their structure and vasomotor function maintained without obvious damage， which may indicate the usage of EDFS40 in vitrification of blood vessels.

　　KEY WORDS: cryopreservation; rabbit; carotid artery; EDFS40; vitrification

　　玻璃化冷冻保存方法采用高浓度低温保护剂(cryoprotective agent， CPA)及较快的降温速率，使细胞内外迅速达到玻璃态，从而避免细胞内外冰晶形成所致的损害，有效地保存组织的活性[16]。高浓度的CPA可以引起组织或细胞的毒性损伤，因此寻求低毒性、高渗透性的CPA或CPA的组合成为关键。在本研究中，我们选用玻璃化溶液EDFS40冷冻保存兔颈总动脉，通过观察复温后血管组织结构和舒缩功能的变化，探讨EDFS40应用于血管玻璃化保存的实际意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 血管的获取

　　健康家兔15只，体重2.5～3.0kg，雌雄不限，以氯胺酮(20mg/kg)、异丙嗪(10mg/kg)、速眠新Ⅱ号(0.3mL/kg)混合液肌注麻醉，切取左右两侧颈总动脉，置于4℃ Hanks溶液中备用。解剖显微镜下仔细清理结缔组织和脂肪组织，将动脉切成10～15mm的血管段，共30段。随机分为新鲜组、EDFS40组和慢速冷冻组。

　　1.2 CPA的配制

　　①玻璃化溶液EDFS40。300g/L聚蔗糖(Ficoll 70000)加0.5mol/L蔗糖，经PBS溶解后制成FS溶液，再用FS溶液与二甲亚砜(dimethyl sulfoxide， DMSO)、乙二醇(ethylene glycol， EG)按6∶2∶2的体积配比后，得到EDFS40。②慢速冻存液。含1.5mol/L DMSO、0.2mol/L蔗糖和200mL/L胎牛血清的RPMI1640。

　　1.3 血管的深低温保存

　　①玻璃化法。EDFS40组血管依次经1.5mol/L EG(室温)、EDFS20(4℃)、EDFS30(4℃)、EDFS40(4℃)溶液分别平衡10、10、5、5min后，放入含有EDFS40的冻存管中，一段血管装入一个冻存管，直接投入-196℃液氮中保存2周。使用前将血管取出，37℃水浴复温，再依次经0.5、0.25、0.125mol/L蔗糖溶液进行EDFS40的洗脱。② 慢速冷冻法。血管经0.75mol/L DMSO(4℃)平衡20min后，放入含有慢速冻存液的冻存管中，一段血管装入一个冻存管。经4℃、-20℃、-80℃梯度降温，平衡60min，投入-196℃液氮中保存2周。使用前取出，37℃水浴复温，以含100mL/L胎牛血清的RPMI1640洗脱慢速冻存液。

　　1.4 形态学的观察

　　①观察动脉的大体形态、色泽、弹性、韧性和完整程度；②苏木精伊红染色，光镜下观察动脉壁3层结构；③透射电镜观察动脉壁内各种成分(内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞)的超微结构。

　　1.5 血管收缩舒张功能的测定

　　从动脉中段截取长度为1mm的动脉环，悬挂于器官浴槽中，并通过张力换能器连接于生理多导仪上，PowerLab数据记录和分析系统根据张力时间曲线确定血管对实验药物的收缩或舒张张力。浴槽中持续通入含950mL/L O2和50mL/L CO2的混合气体，保持pH在7.4左右，温度恒定于37℃，给予4mN静息负荷稳定60min，期间每15min换Na+Krebs液一次。依次选用60mmol/L氯化钾(potassium chloride， KCl)、10-6mol/L去甲肾上腺素(norepinephrine， NE)和10-5mol/L硝普钠(sodium nitroprusside， SNP)进行动脉环收缩或舒张张力的测定。为区别于收缩力，舒张力测得值以负值表示。

　　1.6 统计学分析

　　采用SPSS13.0统计分析软件进行数据处理。实验数据以±s表示，行单因素(one wayANOVA)方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 光镜下各组兔颈总动脉的组织形态学观察

　　EDFS40组和慢速冷冻组动脉大体形态同新鲜血管，长度、管径变化不大，弹性、韧性良好。光镜下同新鲜动脉相比较(图1A)，EDFS40组动脉内皮细胞大多保留，平滑肌细胞和弹力纤维在弹力膜间的分布较均匀，部分血管的外膜欠完整(图1B)。慢速冷冻组动脉内皮细胞基本脱落，部分平滑肌细胞出现变性，弹力纤维模糊，部分外弹力膜欠完整(图1C)。

　　2.2 透射电镜下各组兔颈总动脉的超微结构观察

　　与新鲜动脉的内皮细胞相比较(图2A1)，EDFS40组动脉内皮细胞轻度肿胀隆起，空泡变性，和弹力膜间的间隙增宽(图2B1)；慢速冷冻组动脉仅残留少量内皮细胞，肿胀及空泡变性明显，部分内弹力膜裸露(图2C1)。新鲜动脉的平滑肌细胞梭形，胞内均质，胞核一个(图2A2)；EDFS40组动脉平滑肌细胞肿胀，内质网丰富、高度扩张，线粒体轻度水肿，平滑肌层和胶原排列尚整齐(图2B2)；慢速冷冻组动脉平滑肌细胞变形，线粒体肿胀明显，嵴大部分消失，内质网有不完整的片段存留，部分平滑肌层和胶原排列紊乱，可见融合现象(图2C2)。新鲜动脉的成纤维细胞形态规则(图2A3)；EDFS40组动脉成纤维细胞肿胀，空泡变性，核染色质部分凝集(图2B3)；慢速冷冻组动脉成纤维细胞空泡变性明显，核染色质凝集(图2C3)。

　　2.3 各组兔颈总动脉收缩和舒张张力的变化

　　动脉环非内皮依赖性收缩和舒张张力测定结果(表1)。统计分析显示，EDFS40组动脉对60mmol/L K+的收缩能力和慢速冷冻组无显著性差别(P>0.05)；对10-6mol/L NE和10-5mol/L SNP的收缩或舒张能力优于后者(P<0.05)；但均差于新鲜动脉(P<0.05)。表1 各组兔颈总动脉收缩及舒张张力的变化（略）

　　3 讨论

　　玻璃化冷冻保存方法是快速冷冻与高浓度CPA相结合的结果，该方法操作简单，对组织损伤小，不需要昂贵的仪器设备和特别的工作环境，是生物材料长期深低温保存最有前途的方法[5]。其最大的缺点是高浓度CPA对组织和细胞的毒性作用。因此，降低这种毒副作用、保持玻璃化的形成能力成为该领域研究的重点。随着对低温损伤机制和CPA作用机制等研究的逐步深入，学者们普遍认为，选择玻璃化冷冻保存溶液时应遵循以下原则：选择毒性低、渗透强的CPA；将多种CPA联合应用；添加非渗透性高分子聚合物和小分子糖类；加入与去除CPA的操作过程中保持较低的温度，并缩短样品置入液氮前暴露于玻璃化溶液的时间；选择对相应组织或细胞具有最佳保护效果的CPA；体积>10mL的样品，不管是否加入载体溶液，所需CPA的浓度都要明显高于体积较小的样品。

　　目前，以EG为基本组成的玻璃化溶液被广泛应用于精子、卵子、胚胎、皮肤、卵巢等的玻璃化保存，并取得了可喜的成果。本研究选用由朱士恩等[7]自行研制的EDFS40冷冻保存液，其成份为DMSO、EG、Ficoll 70000和蔗糖。该溶液将成玻璃化能力较强、渗透性略差的DMSO与渗透性强、成玻璃化能力弱的EG进行等比组合，不但避免了单用DMSO或EG所导致其含量过高产生的毒性作用，且使二者的作用互补，使保护剂的渗透性提高，玻璃化状态形成得比较彻底[8]。其次，EDFS40中含有一定浓度的聚蔗糖和蔗糖，有助于提高溶液的黏稠度、减轻细胞肿胀，在冷冻过程中，促进玻璃化形成，防止进一步结冰；并减少进入细胞内的EG或DMSO，从而减轻EG和DMSO对细胞的毒性。
　　
　　血管是一个由内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞组成的活跃而完整的器官，收缩、舒张功能是其基本生理功能，并反映血管的整体活性状态。理想的CPA或CPA组合，应使冻存后血管的组织形态和生理功能得到保持。我们采用EDFS40以四步平衡法快速冷冻家兔颈总动脉，结果显示：血管的大体形态、色泽、弹性、韧性较新鲜血管无明显变化，未出现完全断裂现象。但细胞的超微结构发生了改变，出现内皮细胞肿胀，空泡变性，部分脱落；平滑肌细胞和成纤维细胞的胞浆内可见空泡及核染色质凝集现象，损伤程度轻于慢速冷冻组血管。同样的结果体现在血管舒缩功能的测试上。该组动脉对高浓度K+、NE和SNP的舒缩反应虽较新鲜血管减低，但优于慢速冷冻法保存的动脉。这说明玻璃化冷冻保存溶液EDFS40对兔颈总动脉组织结构和舒缩功能的损伤轻于传统的慢速冷冻法，可尝试将其应用于血管的深低温保存。有关这种玻璃化溶液的毒性及其对血管力学性能和移植效果的影响，还需要进一步的实验证实。

参考文献

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　　[8]朱士恩. 小鼠扩张囊胚细胞膜对不同抗冻保护剂通透性的测定 [J]. 中国农业大学学报， 1998， 3(5):110113.