雷帕霉素对小鼠H22肝癌细胞生长增殖的影响

　　　　 作者：仵正，吕毅，刘原兴，王作仁

【摘要】 目的 研究雷帕霉素(rapamycin， RPM)对h32肝癌细胞生长增殖的影响。方法 体外培养小鼠h32肝细胞癌株，分别与RPM、CsA、FK506和5Fu共同孵育48h，进行MTT实验。流式细胞仪测定各组h32细胞的细胞周期变化，ELISA法测定各组上清液中VEGF含量。体内实验建立h32肝细胞癌皮下移植瘤模型，同时完成C57BL/6→BALB/c小鼠异体皮肤移植模型。给予RPM、CsA、FK506和5Fu灌胃，观察皮片存活情况。获取实验小鼠血清及肿瘤组织。计算各组肿瘤体积，通过CD34免疫组化染色测定各组肿瘤组织的微血管密度(MVD)。结果 剂量为0.01、0.1、1mg/L的RPM对对数生长的h32肝细胞具有细胞毒性，抑制h32小鼠肝癌细胞增殖，培养上清液中的VEGF浓度较对照组显著降低(P<0.05)，细胞周期分析显示S期细胞数较其他免疫抑制剂组显著减少(P<0.05)。体内实验显示给予1.5mg/(kg·d)和4.5mg/(kg·d)的RPM与5mg/(kg·d) FK506、20mg/(kg·d) CsA的皮片存活时间相等，而肿瘤体积显著减小(P<0.05)。与对照组相比，实验剂量RPM显著降低了荷瘤小鼠血清中的VEGF含量(P<0.05)，同时瘤组织内的MVD显著减少(P<0.05)。结论 体外实验研究和动物实验证实，RPM具有抗免疫排斥和抗肿瘤增殖的特点，可能在肝移植治疗肝脏恶性肿瘤方面发挥优势。

【关键词】 雷帕霉素；免疫抑制剂；肝癌；血管内皮细胞生长因子

　　ABSTRACT: Objective To explore rapamycin's inhibitory effect on proliferation of h32 hepatic cancer in mice. Methods In vitro study: h32 hepatic cancer cell lines were cultured with rapamycin， CsA， FK506， and 5FU， respectively， for 48h. The different drugs' inhibitory effect on proliferation was determined through MTT. The influences of different agents on the h32 hepatic cancer cell cycle were observed by flow cytometry. The vascular endothelial growth factor (VEGF) concentration of the supernatant fluid of the cultured h32 hepatic cancer cell was detected by ELISA. In vivo study: C57BL/6 to Balb/c mice allogenic skin transplant was established， and the h32 hepatic cancer cell was implanted under skin. Rapamycin， CsA， FK506 and 5FU were fed to the mice， respectively. The effect of different immunosuppressors on the survival of skin graft was observed while the proliferation of the transplant tumor was investigated. VEGF concentration of treated mice serum was examined by ELISA. The microvessel density of the transplanted tumor was observed through immunohistochemistry staining of CD34. Results The proliferation of the h32 hepatic cancer cells was inhibited by rapamycin at the concentration of 0.01-1mg/L. When the h32 hepatic cancer cells were cultured with different dose of rapamycin， the VEGF concentration of the supernatant fluid decreased significantly (P<0.05). The number of S phase cells decreased significantly compared to that of other agents (P<0.05). When the mice in different groups were fed with 1.5mg/(kg·d) and 4.5mg/(kg·d) rapamycin， the lengthened survival time of the skin grafts was similar to that in CsA and FK506 groups. But the tumor volume was smaller than that in CsA and FK506 groups (P<0.05). Compared to that in the control group， the VEGF concentration of mice serum decreased in rapamycin group (P<0.05)， and the microvessel density of the transplant tumor was reduced greatly (P<0.05). Conclusion Rapamycin， as an immunosuppressor， significantly resists immunologic rejection and inhibits the proliferation of h32 hepatic cancer， thus having its advantage in treating malignant hepatic cancer with liver transplantation.

　　KEY WORDS: rapamycin; immunosuppressor; hepatic cancer; vascular endothelial growth factor (VEGF)

　　临床资料表明，肝癌患者接受肝移植治疗的总体疗效还不能令人满意，移植术后肝癌复发的问题一直是肝癌肝移植需要解决的关键问题之一。肝癌肝移植术后复发与围手术期应用的免疫抑制剂有相当密切的联系。本研究将探讨免疫抑制剂雷帕霉素(rapamycin， RPM)对h32肝癌细胞生长增殖的影响，为防治肝移植术后肝癌复发的研究提供基础理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　雷帕霉素(rapamycin，福建省微生物研究所)，环孢素A(CsA，Novartis公司)，普乐可复(FK506，日本藤泽制药公司)，5氟尿嘧啶(5Fu，上海旭东海普药业有限公司)，噻唑蓝(MTT，Sigma公司)，Coulter DNAPrep Reagents Kit(Beckman Coulter公司)，Quantikine Mmouse VEGF Immunoassay试剂盒(R&D Systems公司)，Rat AntiMouse CD34(Southern Biotechnology Associates， Inc.)等。

　　1.2 方法

　　1.2.1 噻唑蓝比色实验(MTT)

　　体外培养小鼠h32肝细胞癌株，分别与不同浓度的RPM(0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L)、CsA(1mg/L)、FK506(0.1mg/L)和5Fu(10mmol/L)在96孔培养板共同孵育48h后，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，继续孵育4h，终止培养，离心后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡10min，使活细胞内的蓝紫色结晶物充分溶解。选择490nm波长，以酶联免疫检测仪检测各孔的吸光度值(A)，记录结果。

　　1.2.2 细胞的周期变化测定

　　体外培养小鼠h32肝细胞癌株分别与不同浓度的RPM(0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L)、CsA、FK506和5Fu在24孔培养板共同孵育48h后终止孵育，700mL/L的冷乙醇固定60min。离心，PBS洗涤2次，加100μL的PBS重悬细胞，每份待检细胞数1×106，分别加入DNAPrep Stain 400μL，常温下染色20min。离心洗涤后将样品用300目尼龙膜过滤。用流式细胞仪检测，multicycle分析软件对样本进行细胞周期分析。

　　1.2.3 VEGF含量的测定

　　用ELISA法测定各组上清液中VEGF含量。将培养瓶内对数生长的小鼠肝癌细胞h32，以含20mL/L小牛血清的RPMI1640细胞培养液配成1×108 cells/L的细胞悬液，以每孔2×104 cells、200μL接种于96孔培养板上孵育24h，离心弃去孔内上清液，按实验设计以含不同浓度药物的培养液分别加入各孔内，每一浓度重复6孔，孵育48h。离心，每孔吸取100μL上清液作为测试样品-80℃冷冻保存备用。依照试剂说明准备所有的试剂、工作标准品和样品，通过分光光度仪读取各孔的A值，并依此值绘制标准曲线，计算各孔内样品的VEGF浓度。

　　1.2.4 体内实验

　　各组小鼠首先建立h32肝细胞癌皮下移植瘤模型，皮下移植瘤模型建立后当天完成C57BL/6小鼠→BALB/c小鼠异体皮肤移植。RPM[1.5mg/(kg·d)、4.5mg/(kg·d)]、CsA[20mg/(kg·d)]、FK506[5mg/(kg·d)]和5Fu[50mg/(kg·d)]灌胃14d，观察皮片存活情况，模型建立24d剖杀小鼠，留取血清及肿瘤组织。计算各组肿瘤体积，ELISA法测定各组小鼠血清中VEGF含量，通过CD34免疫组化染色测定各组肿瘤组织的微血管密度(MVD)。对照组用CMCNa 0.005mg/mL灌胃。

　　1.2.5 统计学方法

　　采用SPSS11.0统计软件，实验数据采用均数±标准差(±s)表示，组间比较用方差分析、LSD检验、Dunnet t2 t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT实验

　　体外培养小鼠h32肝细胞癌株进行MTT实验，根据如下公式计算各组抑制率：抑制率(%)=[1-(实验组A均数)/(对照组A均数)]×100%。

　　如图1所示，5Fu作为代表性的常用化疗药物对于体外培养的h32小鼠肝癌细胞具有显著的杀伤效果，细胞增殖抑制率为52.8%，与3种免疫抑制剂相比有显著性差异(P<0.05)。免疫抑制剂CsA和FK506对于h32小鼠肝癌细胞没有显著的抑制增殖的作用，而不同浓度的RPM有一定的抑制h32小鼠肝癌细胞增殖的作用。中、高浓度的RPM对h32小鼠肝癌细胞增殖的抑制率与CsA和FK506相比差异具有显著性(P<0.05)。RPM中、高浓度(0.1 mg/L、1mg/L)组与低浓度(0.01mg/L)组相比抑制h32小鼠肝癌细胞增殖率差异有显著性(P<0.05)，而中、高浓度组间相比无显著性差异。

　　2.2 细胞周期分析

　　体外培养对数生长的h32小鼠肝癌细胞株，在不同的免疫制剂和5Fu分别作用48h后，应用流式细胞仪测定各组细胞的细胞周期分布变化，显示不同浓度的RPM、CsA、FK506对于h32小鼠肝癌细胞周期的影响不同。采用流式细胞仪测定的各组细胞细胞周期变化见表1。表1 不同免疫抑制剂对h32小鼠肝癌细胞周期的影响（略）

　　RPM对h32小鼠肝癌细胞周期的影响表现为G0/G1期细胞数增多而S期细胞数减少。应用不同浓度的RPM后h32小鼠肝癌细胞G0/G1期细胞数由25.38%增加到30.89%～34.00%，而S期细胞数由42.00% 降至37.13%～32.20%，结果与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05)。RPM中、高浓度组与低浓度组相比对细胞周期的影响更显著，结果具有统计学意义(P<0.05)；而中、高浓度组间相比没有显著性差异。CsA和FK506作用下的h32小鼠肝癌细胞G0/G1期细胞数减少，S期细胞数无明显变化。不同浓度RPM对于h32细胞周期的影响与CsA和FK506相比具有统计学意义(P<0.05)。中、高浓度的RPM与5Fu对h32小鼠肝癌细胞周期的影响作用类似。

　　2.3 皮片存活情况

　　实验中小鼠C57BL/6→BALB/c异体皮肤移植模型建立成功，不同组间皮肤移植物存活时间表现出较大的差异性。根据移植皮片排斥时间的确定标准，统计分析各组皮片平均存活时间。当受者小鼠给予不同剂量的RPM[1.5mg/(kg·d)，4.5mg/(kg·d)]、CsA[20mg/(kg·d)]、FK506[5mg/(kg·d)]灌胃后，移植物存活明显延长，平均存活17.7～18.5d，与对照组(6.1～8.7d)比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.4 肿瘤体积

　　对照组小鼠在接种h32小鼠肝癌细胞后一般在第5～7天在种植部位可以触摸到一小米粒大小的瘤块，第14天左右瘤块一般即非常明显。肿瘤种植到小鼠腹股沟皮下后第24天剖杀小鼠测定到的肿瘤体积，经ANOVA方差分析各组数据方差齐并且组间有差异(P<0.05)。由图2可见，各实验组间两两比较结果显示实验剂量的CsA和FK506促进了小鼠皮下移植瘤的生长，其肿瘤体积明显较对照组增大(P<0.05)。而实验剂量的RPM在相同的条件下抑制了肿瘤的生长，瘤组织的体积较对照组小(P<0.05)。联合应用RPM和CsA或者FK506时，比单用CsA或者FK506时肿瘤体积明显缩小，差异具有显著性(P<0.05)。表2 不同免疫抑制剂对h32肝癌细胞培养液上清中VEGF浓度的影响（略）

　　2.5 ELISA法测定VEGF含量

　　依据试剂盒提供的标准品测定的结果绘制工作标准曲线，用SSPS软件进行直线回归分析，建立回归方程：VEGF浓度=-28.598＋(A值×196.746)。根据公式计算出各实验组的h32小鼠肝癌细胞培养上清液中VEGF浓度(表2)。在各组细胞培养上清液中，VEGF含量有差异，不同浓度的RPM作用下上清液中VEGF浓度显著减低(P<0.05)。0.1mg/L FK506作用下上清液中VEGF浓度显著减低(P<0.05)。1mg/L CsA作用下VEGF浓度略有提高。

　　体内实验的各组实验小鼠中，1.5mg/(kg·d)和4.5mg/(kg·d)的实验剂量RPM可降低荷瘤小鼠血清中的VEGF浓度(P<0.05)。5Fu治疗组血清中的VEGF浓度也显著降低，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。服用CsA的小鼠血清中的VEGF浓度较对照组升高(P<0.05)。FK506组VEGF浓度与对照组比较没有明显差异(表3)。表3 荷瘤小鼠血清中VEGF浓度的测定结果（略）

　　2.6 肿瘤组织内MVD的测定

　　各组小鼠皮下移植瘤瘤块中均可见到CD34阳性染色，肿瘤组织内的血管内皮CD34呈强免疫反应。根据实验原则计算标本的微血管密度(MVD)(表4)。应用实验剂量的RPM可以显著地减少瘤组织内的微血管密度，结果具有统计学意义(P<0.05)。其余各组MVD值与对照组相比没有显著差异。表4 小鼠瘤组织内MVD的测定结果（略）

　　3 讨 论

　　肝胆恶性肿瘤患者移植术后2年内肝癌复发率高于60%[1]，免疫抑制剂的使用可加速肿瘤生长[2]。术后肿瘤复发成为阻碍肝癌肝移植临床广泛开展的最主要问题之一。由于作用机理、作用环节不同，不同的免疫抑制剂的免疫抑制作用与效果也不同。应用大剂量糖皮质激素作为免疫抑制剂时，肝癌肝移植术后肝癌复发率显著增高[3]。选用新的免疫抑制剂有可能降低肝移植术后肝癌的复发率。

　　RPM是链霉菌属丝状菌发酵产生的一种具有抗真菌作用的大环内酯类抗生素。1999年，美国FDA批准RPM应用于临床器官移植。RPM发挥免疫抑制作用的机制包括[45]：①通过抑制真核生物启动因子4E结合蛋白1(4EBPl)的磷酸化，阻止eIF4E的释放和转录；②抑制P27介导的cdk2细胞周期素的激活和DNA的合成；③抑制P70S6激酶活化，阻遏核糖体蛋白S6磷酸化，减少核糖体/转录蛋白的合成，最终抑制T细胞Gl后期向S期过渡。
　　
　　本研究中，RPM具有同CsA、FK506同效的免疫抑制作用，均显著延长了皮肤移植物生存时间。但是，仅RPM显著抑制h32肝细胞癌株的生长增殖。
　　
　　RPM对于细胞周期的影响是其成为免疫抑制剂的基础之一，也是其具有抗肿瘤特性的主要因素。在本实验中，我们观察到剂量为0.01、0.1、1mg/L的RPM与对数生长的h32肝细胞癌株分别共同培养48h后，表现出一定的细胞毒性作用。同时进入实验的剂量为1mg/L的CsA和0.1mg/L的FK506对于h32肝细胞癌细胞没有明显的抑制作用。在细胞周期分析中可见到在不同浓度的RPM作用下，对h32小鼠肝癌细胞周期的影响表现为G0/G1期细胞数增多而S期细胞数减少。1mg/L的CsA和0.1mg/L的FK506与h32肝细胞癌细胞共同培养，没有增加其细胞周期G0/G1期细胞数。提示RPM具有将h32细胞生长阻滞在G0/G1期的效果。这与国外学者SCHUMACHER[6]对于人肝癌细胞株体外培养的研究结果基本一致。
　　
　　RPM抑制肿瘤增殖的作用还被发现与其能够抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)有关。本研究发现剂量为0.01、0.1、1mg/L的RPM与h32小鼠肝细胞癌细胞株共同培养48h后，培养液上清中VEGF浓度显著减低(P<0.05)，提示不同剂量的RPM均具有显著抑制h32小鼠肝细胞癌细胞生成VEGF的能力。在体内实验中实验剂量的RPM可降低荷瘤小鼠血清中的VEGF浓度，有效抑制了瘤组织内肿瘤血管形成，使微血管密度(MVD)由52.60降至23.77～26.90，在此基础上RPM显著抑制了h32细胞增殖，使瘤体积较对照组缩小。证实RPM抑制肿瘤生长与抑制肿瘤新生血管形成密切相关，这与GUBA等[7]在结肠腺癌细胞形成肝脏转移瘤模型上的实验结论类似。上海中山医院关于人肝癌细胞株的研究也证实这一结果[8]。
　　
　　本研究中，临床常用的免疫抑制剂CsA、FK506都表现出显著促进h32皮下移植瘤增殖的现象，而RPM作为一个高效的免疫抑制剂的同时具有与经典化疗药物5FU效果类似的抗肿瘤增殖特性。上海中山医院的临床肝移植经验初步提示，RPM可以改善超过米兰标准的肝癌肝移植预后[9]。因此，RPM替代CsA可能会减少癌症在高危移植病人中的发生或再发[911]。相信在未来RPM将在肝脏移植术后免疫抑制治疗中占据应有的地位。特别是体外实验研究和动物实验证实，RPM具有抗肿瘤增殖的特点，它将会在肝移植治疗肝脏恶性肿瘤方面发挥其优势。

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