作者：朱克修，李玢，邓卓，袁彩萍，慕建宁，韩晓兵
【摘要】 目的 从定性定量角度探讨粉防己碱诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用。方法 采用MTT法检测不同浓度粉防己碱作用不同时间对人宫颈癌HeLa细胞株的增殖抑制作用。通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡情况。结果 粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞具有增殖抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。应用流式细胞仪检测到15μmol/L粉防己碱诱导HeLa细胞产生的凋亡率为(51.8±0.97)%，显著高于对照组凋亡率(24.3±1.23)%(P<0.05)。通过激光共聚焦显微镜观察，与对照组比较，粉防己碱作用后HeLa细胞具有明显的凋亡形态。结论 粉防己碱能够抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡。
【关键词】 粉防己碱；宫颈癌；凋亡；
ChinaABSTRACT: Objective To study the effects of tetrandrine on apoptosis of HeLa cervical cancer cells qualitatively and quantitatively. Methods We measured tetrandrine-induced inhibition of HeLa cell proliferation at different concentrations and time points by MTT assay. The rate of Hela cell apoptosis induced by tetrandrine was detected by flow cytometer and confocal laser scanning microscope (CLSM). Results Tetrandrine inhibited the proliferation of HeLa cells in dosage- and time-dependent manners. Flow cytometry showed that the apoptosis rate was (51.8±0.97)% at the concentration of 15μmol/L， which was significantly higher than that in the control group (24.3±1.23)% (P<0.05). The cells treated with tetrandrine showed typical apoptotic morphology under CLSM. Conclusion Tetrandrine can inhibit proliferation and induce apoptosis of HeLa cervical cancer cells.
KEY WORDS: tetrandrine; cervical cancer; apoptosis
全球每年估计约有470000例新增的宫颈癌病例，并且每年约有230000例宫颈癌患者死亡。发展中国家占80%，在发展中国家的很多地区，宫颈癌是最常见的肿瘤[1-2]。早期宫颈癌的治疗主要是通过手术，进展期的宫颈癌主要通过体外放射线和体腔内放射线治疗。近年来有很多关于放、化疗结合的研究。但是，放疗和化疗以及放、化疗均有明显的副作用，所以能否利用一些毒副作用较小的药物来治疗宫颈癌是一个值得研究的问题。
粉防己碱(tetrandrine， Tet)是从中草药防己的根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱，具有广泛的药理作用，临床用于治疗关节炎、高血压、心率失常和肺纤维化等疾病具有较好的疗效[3-8]。许多研究认为粉防己碱是一种有前途的抗癌药物，可以抑制多种肿瘤细胞的生长[9-14]。然而，粉防己碱对宫颈癌细胞是否具有抑制增殖的作用尚未见报道。本实验以宫颈癌HeLa细胞为处理对象，以不同剂量的粉防己碱处理，观察其诱导HeLa细胞凋亡的作用，为抗宫颈癌药物治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
RPMI1640培养基购自GIBCO公司，粉防己碱(Tet)购自上海友思生物技术有限公司，根据文献[7]以双蒸水稀释粉防己碱，配置浓度为0.1mmol/L的粉防己碱储存液(0.1mol/L HCl助溶，0.1mol/L NaOH调整pH值至6.6～6.7)，4℃保存，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Amresco公司，Annexin-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Bipec公司，胰蛋白酶，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。
1.2 细胞株和细胞培养
宫颈癌HeLa细胞株由西安交通大学临床医学研究分子中心提供。常规培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养条件为37℃，50mL/L CO2饱和湿度，待细胞长至80%融合时，2.5g/L胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。
1.3 MTT法检测宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制率
取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞浓度5×104个/mL，以200μL/孔接种于96孔板，37℃，50mL/L CO2培养箱中培养24h，以粉防己碱终浓度为10、12.5、15、17.5、20、30μmol/L处理细胞。每个浓度设三个平行孔，并同时设阴性对照和空白对照，分别于作用24、48、72h后每孔加入50mg/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4h后，终止培养，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪在490nm处测量A值，按以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。
1.4 实验分组
实验分为对照组和处理组。对照组即正常生长的HeLa细胞；处理组即给予粉防己碱处理的Hela细胞。
1.5 AnnexinV/PI双染法流式细胞数检测细胞凋亡
以0μmol/L，15μmol/L粉防己碱处理细胞24h后，收集细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL。取1mL细胞，2000r/min，4℃，离心10min，弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞，400μL 1×Binding Buffer重悬细胞，密度为1×106个/mL。加5μL AnnexinV-FITC，轻柔混匀，在4～8℃避光孵育15min。再加10μL PI，在4～8℃避光孵育5min。于1h内上流式细胞仪检测。
1.6 AnnexinV/PI双染法激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学变化
将对数生长期HeLa细胞以1×105个/mL接种于预先置有盖玻片的无菌6孔板中，终体积为2.5mL。待24h贴壁后，加入粉防己碱，使其在培养基中终浓度为15μmol/L，同时设不加药的对照组。作用24h后，按AnnexinV-PI细胞凋亡试剂盒步骤染色，封片后立即用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞并拍照。结果判定：正常活细胞AnnexinV和PI均为低染；凋亡早期的细胞膜完整，AnnexinV高染呈绿色，PI为低染；凋亡中晚期细胞则AnnexinV和PI均为高染，细胞膜呈绿色，细胞核呈红色。
1.7 统计学处理
实验均重复3遍，实验结果用均数±标准差(±s)表示，并用SPSS13.0软件对实验结果进行分析。MTT法试验结果用两因素方差分析检验，其余试验结果进行两独立样本均数的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞具有增殖抑制作用
MTT实验结果显示，当粉防己碱的浓度在10μmol/L以上时，对HeLa细胞的生长具有抑制作用，且随着浓度和时间的增加，抑制率逐渐增高，具有时间、浓度依赖性。随着浓度的增加，作用24h后，抑制率增加明显，24h IC50为17μmol/L。而作用48h后，各浓度抑制率均达60%以上。至作用72h，各浓度抑制率已达90%以上(P<0.05，图1)。
2.2 流式细胞术检测粉防己碱诱导各组细胞的凋亡情况
结果显示，用0μmol/L、15μmol/L粉防己碱处理细胞24h后，处理组细胞凋亡率为(51.8±0.97)%，明显高于对照组凋亡率[(24.3±1.23)%](P<0.05，图2)。
2.3 AnnexinV/PI双染法激光共聚焦显微镜观察细胞形态学的变化
未加粉防己碱的空白对照组细胞AnnexinV和PI均为低染；处理组(15μmol/L)作用24h后出现AnnexinV和PI多为高染的中、晚期凋亡细胞。说明粉防己碱对HeLa细胞具有诱导其凋亡的作用。与流式细胞仪检测结果基本一致(图3)。
3 讨 论
宫颈癌是世界范围内女性第二大恶性肿瘤，占所有肿瘤的10%。传统的宫颈癌治疗模式与分期密切相关，Ⅰ期、ⅡA期以手术为主，辅以放疗，ⅡB期以上以放疗为主，辅以手术和化疗。近年来，随着肿瘤化学治疗的基础与临床研究的迅速发展，化疗药物的不断开发及给药途径和方法的改进，以顺铂(DDP)为核心的联合化疗及放化疗在宫颈癌治疗中取得了一定疗效，然而化疗与放疗均有严重的副作用。因此，寻找副作用小同时对肿瘤又有较好的抑制作用的药物成为目前研究的一个热点。
许多研究证明，粉防己碱在肿瘤细胞和动物模型中都具有抗癌作用。其用于肿瘤治疗主要包括以下几方面：①直接抗肿瘤作用。通过激活凋亡相关基因，诱导肿瘤细胞凋亡或通过影响细胞周期进程，发挥直接抗肿瘤作用。大量研究证明，粉防己碱可以使许多细胞如U937、HL60、A549、HepG2和T细胞发生G1期阻滞和凋亡，从而抑制人肝细胞癌，乳腺癌及食管癌，结肠癌，卵巢癌等肿瘤细胞的生长[9-11]。②放疗增敏作用。通过抑制放射线引起的潜在致死性损伤的修复，及诱导凋亡的作用，实现放疗增敏的作用[15]。③减毒作用。研究表明粉防己碱可通过增高人体内SOD活性降低脂质过氧化物水平，减轻阿霉素引起的心肌损害[16]，或通过抑制炎症反应而起到减轻毒性反应的作用[17]。④逆转耐药性。通过作用于P-糖蛋白(P-gP)，使其外排泵功能失活从而提高细胞内药物浓度[18]，或通过下调多药耐药相关蛋白(MRP)，逆转多药耐药(MDR)等机制抗肿瘤。
本实验通过MTT法检测，得到粉防已碱对HeLa细胞具有抑制作用，且随着浓度和时间的增加，抑制率逐渐增高，具有时间、浓度依赖性。为了确定粉防己碱引起的HeLa细胞增殖抑制作用是否通过凋亡途径实现，本实验同时也利用AnnexinV/PI双染法，经流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞的凋亡情况，结果均证实粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞具有促进凋亡的作用。细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)，是指在一定生理和病理情况下机体为维持内环境稳定，通过基因调控而使细胞主动有序的消亡过程，是多细胞生物的一种生理性细胞死亡。凋亡不仅对胚胎发生、器官发育及保护机体稳态等至关重要，而且在控制细胞增殖、调节肿瘤的发生和生长中起着重要的作用。凋亡负调控肿瘤的发生发展，通过凋亡机体可及时清除过多受损但来不及修复的或生理上不需要的细胞。细胞的凋亡受阻从而导致细胞群体凋亡和增殖的平衡受到破坏，异常细胞增殖速度超过凋亡速度，从而形成肿瘤[19]。本实验结果证明粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞具有一定的促凋亡作用，有作为宫颈癌药物治疗的可能性。
在今后的实验中，我们将进一步检测粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞是否具有周期阻滞作用，并检测与细胞周期阻滞和凋亡相关的蛋白，更加深入的了解粉防己碱对HeLa细胞的增殖抑制的分子机制。
参考文献
[1]PARKIN DM. Global cancer statistics in the year 2000 [J]. Lancet Oncol， 2001， 2(9):533-543.
[2]PARKIN DM，BRAY F， FERLAY J， et al. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000 [J]. Int J Cancer， 2001， 94(2):153-156.
[3]PANG L， HOULT JR. Cytotoxicity to macrophages of tetrandrine， an antisilicosis alkaloid， accompanied by an overproduction of prostaglandins [J]. Biochem Pharmacol， 1997， 53(6):773-782.
[4]ONAI N， TSUNOKAWA T， SUDA M， et al. Inhibitory effects of bisbenzylisoquinoline alkaloids on induction of proinflammatory cytokines， interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha [J]. Planta Med， 1995， 61(6):497-501.
[5]WANG G， LEMOS JR. Tetrandrine:a new ligand to block voltage-dependent Ca2+ and Ca(+)-activated K+ channels [J]. Life Sci， 1995， 56(5):295-306.
[6]CAO ZF. Scavenging effect of tetrandrine of active oxygen radicals [J]. Planta Med， 1996， 62(5):413-414.
[7]韩晓兵，柳友清，卢运萍，等. 粉防已碱对人卵巢癌细胞株A2780增殖与凋亡的影响 [J].中国肿瘤临床， 2006， 33(4):190-193.
[8]JIN Q， KANG C， SOH Y， et al. Tetrandrine cytotoxicity and its dual effect on oxidative stress-induced apoptosis through modulating cellular redox states in Neuro 2a mouse neuroblastoma cells [J]. Life Sci， 2002， 71(17):2053-2066.
[9]LAI YL， ChEN YJ， WU TY， et al. Induction of apoptosis in human leukemic U937 cells by tetrandrine [J]. Anticancer Drugs， 1998， 9(1):77-81.
[10]OH SH， LEE BH. Induction of apoptosis in human hepatoblastoma cells by tetrandrine via caspase-dependent Bid cleavage and cytochrome c release [J]. Biochem Pharmacol， 2003， 66(5):725-731.
[11]YOO SM， OH SH， LEE SJ， et al. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by tetrandrine in HepG2 cells [J]. J Ethnopharmacol， 2002， 81(2):225-229.
[12]KUO PL， LIN CC. Tetrandrine-induced cell cycle arrest and apoptosis in Hep G2 cells [J]. Life Sci， 2003， 73(2):243-252.
[13]YASUKAWA K， AKASU M， TAKEUCHI M， et al. Bisbenzylisoquinoline alkaloids inhibit tumor promotion by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin [J]. Oncology， 1993， 50(2):137-140.
[14]MENG LH， ZHANG HL， HAYWARD L， et al. Tetrandrine induces early G1 arrest in human colon carcinoma cells by down-regulating the activity and inducing the degradation of G1-S–specific cyclin-dependent kinases and by inducing p53 and p21Cip1 [J]. Cancer Research， 2004， 64:9086-9092.
[15]陈宝安，王为，林国为，等. 汉防己甲素抗肿瘤作用的研究进展 [J]. 南京中医药大学学报， 2001， 17(2):128-129.
[16]李福全，马春力，张明远，等. 粉防己碱对阿霉素心脏损害大鼠的保护作 [J]. 佳木斯医学院学报， 1994， 17(6):12.
[17]CHEN YJ， DAI YS， CHEC BF. The effect of tetrandrine and extracts of centella asiatice on acute radiation dermatitis in rats [J]. Bio Pharm Bull， 1999， 22(7):703.
[18]许文林，钱军，费霞，等. 汉防己甲素逆转血液系统肿瘤细胞多药耐药的临床观察 [J]. 中华血液杂志， 1999， 20(7):383.
[19]周爱枝，胡平，任青，等. 丹参酮2A联合顺铂对Hela细胞生长及p53蛋白表达水平的影响 [J]. 郧阳医学院学报， 2007， 26(6):339-344.