作者：卫小红，马爱群，邵杰，杨岚，陈明伟，王军辉
【摘要】 目的 探讨肺耐药相关蛋白(LRP)、血管内皮生长因子(VEGF)及微血管密度(MVD)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的变化、相互关系及可能的机制。方法 应用免疫组化技术检测56例NSCLC癌组织和27例正常对照肺组织中LRP、VEGF表达及MVD情况。结果 ①LRP阳性表达分布于癌细胞胞浆内，表达率66.1%，显著高于对照肺组织(P<0.01)，其显著性与病理类型无关；NSCLC组LRP的表达在不同性别、TNM分期、有无淋巴结转移及两年生存率的比较上均无明显统计学意义(P>0.05)。②与对照组比较，NSCLC组VEGF表达明显升高(P<0.01)，其显著性与病理类型无关。NSCLC组VEGF表达与TNM分期、有无淋巴结转移相关(P<0.05)。③NSCLC组MVD明显高于对照组(P<0.01)，其显著性不受病理类型、病理分级的影响。MVD在Ⅲ+Ⅳ期肺癌中为18.5±5.8，明显高于Ⅰ期的13.8±5.1(P<0.05)，有淋巴结转移的高于无淋巴结转移者(P<0.05)，两年存活的MVD低于两年死亡的MVD(P<0.01)。④NSCLC组VEGF、LRP高表达和MVD增高具有一致性(P<0.05)。结论 非小细胞肺癌血管生成与肺耐药相关基因具有一定的相关性。LRP的高表达可能与VEGF上调其基因及VEGF促进肿瘤MVD增加有关。抑制肿瘤新生血管的生成有望降低甚或遏制对非小细胞肺癌化疗的耐药性。
【关键词】 非小细胞肺癌；肺耐药相关蛋白；血管生成；免疫组化
ChinaABSTRACT: Objective To investigate the changes in lung resistance-related protein (LRP) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expressions and micro-vessel density (MVD) in non-small cell lung cancer (NSCLC)， and to elucidate their possible relationship and mechanism. Methods Immunohistochemistry was used to detect changes in LRP and VEGF expressions， and MVD level in lung tissues of 56 NSCLC cases and 27 normal controls. Results ① LRP expression (66.1%) was concentrated in the cytoplasm of cancer cells， which was significantly higher than that in lung tissues of control group (P<0.01); the significance was not related to the pathological type. There was no significant difference in LRP expression among gender， TNM stage， lymph node metastasis， and two-year survival in NSCLC (P>0.05). ② In comparison to the control group， NSCLC group had significantly increased VEGF expression (P<0.01)， which was not related to the pathological type. VEGF expression in NSCLC group had a significant association with TNM stage and lymph node metastasis (P<0.05). ③ The NSCLC group had a significantly higher MVD than the control group (P<0.01)， which was not affected by the pathological type or degree. MVD value (18.5±5.8) of stage Ⅲ and Ⅳ in NSCLC group was significantly higher than that (13.8±5.1) of stage Ⅰ (P<0.05); MVD value for patients with lymph node metastasis was higher than that without lymph node metastasis (P<0.05); MVD value for patients with two-year survival was less than those who died within two years (P<0.01). ④ NSCLC group with high VEGF and LRP expressions had a consistently increased MVD value (P<0.05). Conclusion There is a certain relationship between tumor angiogenesis and LRP expression in NSCLC. VEGF is responsible for the high expression of LRP through up-regulating LRP gene and augmenting tumor MVD. Inhibition of angiogenesis in tumor is expected to reduce or inhibit drug resistance to NSCLC.
KEY WORDS: non-small cell lung cancer (NSCLC); lung resistance-related protein (LRP); angiogenesis; immunohistochemistry
肿瘤细胞对化疗药物产生原发或继发耐药是化疗失败的主要原因之一。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)耐药是多因素、多基因参与的过程，不仅与耐药相关基因及其编码蛋白过度表达有关，亦可能涉及肿瘤的血管生成[1]。因此，探讨耐药相关蛋白和血管生成的关系将有助于了解其耐药机制并为进一步研究逆转耐药提供理论基础。本研究采用免疫组化技术检测NSCLC组织中肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein， LRP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)的表达及微血管密度(micro-vascular density， MVD)，并探讨它们之间的关系，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源及分组
本院2004年12月～2006年6月经手术切除的NSCLC患者(男39，女17)标本56例作为NSCLC组，年龄36～69(56.5±11.5)岁。其中鳞癌30例，腺癌26例(包括肺泡细胞癌4例)。TNM Ⅰ期20例，Ⅱ期12例，Ⅲ期21例，Ⅳ期3例。有肺门、纵隔淋巴结转移22例，无淋巴结转移34例。另随机选取同期因外伤或其他良性病变行肺叶切除术患者的正常肺组织标本27例(男20，女7)作为对照组，其中取自支气管断裂肺挫裂伤5例，肺炎性假瘤6例，慢性肺脓肿3例，肺结核6例，肺良性肿瘤4例，气胸3例。年龄25～64(50±16.85)岁。术后常规随访。两组性别、年龄构成差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 主要试剂
兔抗人多克隆抗Ⅷ因子抗体、兔抗人单克隆抗LRP抗体、兔抗人多克隆抗VEGF抗体、DAB显色试剂盒等均购自福州迈新公司。
1.3 方法
按照产品说明书进行SP免疫组织化学染色：每组实验均设有阳性和阴性对照。阳性对照为福州迈新公司提供的含已知待检抗原的切片；阴性对照在上述操作过程中以PBS缓冲液代替一抗。
1.4 结果判定
1.4.1 MVD
用抗Ⅷ因子抗体标记血管内皮细胞，可见呈棕色或棕黄色染色的血管内皮细胞，先在低倍镜(4×15)下观察确定微血管数量最多的部位，再在高倍镜(10×15)下以与周围细胞和结缔组织成分有明显区别的任何一个阳性染色的内皮细胞或细胞丛为一个血管，只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管。肿瘤内硬化区及与肿瘤交界处软组织内的微血管、有厚的平滑肌及管腔直径大于8个红细胞的血管除外。高倍镜下分别计数3个视野，取其平均值即为平均MVD。
1.4.2 VEGF表达
细胞质呈现棕黄色颗粒状染色，且着色明显高于背景或背景不着色而细胞着色者为阳性。按染色强度(未着色、弱、中、强)及阳性细胞的百分数(0%，1～25%，26～50%，>50%，)分别积分为0、1、2、3，两项分数之和为0～2分者计为VEGF表达阴性，3～6分者计为VEGF表达阳性。
1.4.3 LRP表达
结果判定同VEGF。
1.5 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，多组间均数比较采用方差分析，两两比较采用最小显著差异t检验，方差不齐时采用非参数检验，计数资料采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 LRP、VEGF蛋白和MVD的表达情况
LRP和VEGF的阳性表达主要分布于细胞浆内，细胞核未见表达。在对照组的表达主要分布于间质细胞的胞质内，偶见吞噬细胞内的阳性表达(图1)。
2.2 LRP、VEGF表达和MVD与病理特征的关系
与对照组比较，LRP在NSCLC组织的表达明显升高(P<0.01)，G1+G2、G3与对照比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。VEGF在NSCLC表达高于对照(P<0.01)，G1+G2、G3与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。在MVD的比较上，NSCLC组明显高于对照组(P<0.01)；G1+G2、G3与对照比较差异有统计学意义(P<0.01)。
LRP、VEGF、MVD各自在不同病理类型、病理分级之间的比较无统计学差异(P>0.05，表1)。表1 LRP、VEGF表达和MVD与临床病理的关系（略）注：P均为与对照组比较结果。
2.3 LRP、VEGF表达和MVD与临床特征之间的关系
VEGF表达在不同TNM分期中有非常显著性差异(P<0.01)，有淋巴结转移的VEGF表达阳性率高于无淋巴结转移者(P<0.05)。MVD在Ⅲ+Ⅳ期明显高于Ⅰ期(P<0.05)；有淋巴结转移的MVD高于无淋巴结转移(P<0.05)；两年存活的MVD低于两年死亡的MVD(P<0.01)。LRP的表达在不同性别、TNM分期、有无淋巴结转移及两年生存率的比较上均无明显统计学意义(P>0.05)；VEGF表达在不同性别、两年生存的比较上无统计学意义(P>0.05)；MVD与不同性别无明显相关性(P>0.05，表2)。表2 LRP、VEGF表达和MVD与临床特征的关系（略）注：TNM分期中LRP和VEGF的P值为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ期的比较；MVD的P值为Ⅰ与Ⅲ+Ⅳ期的比较。
2.4 LRP、VEGF蛋白表达和MVD之间的关系
LRP表达的肺癌组织中MVD为17.8±5.1，与不表达肺癌组织中MVD13.7±4.3比较，两者差异性显著(P<0.01)。MVD在VEGF表达阳性的肺癌组织中为16.8±4.7，在VEGF阴性的肺癌组织中MVD为13.0±4.1，两者间差异有统计学意义(P<0.01)。在非小细胞肺癌组织标本中LRP与VEGF表达相关(P<0.05)。
3 讨 论
NSCLC对常用化疗药物耐药是影响化疗效果和患者生存率的重要原因之一，也是困扰人们的一大难题。多种因素、多个基因及蛋白参与了NSCLC的耐药，包括LRP和VEGF等[1-2]。
LRP是一种仅表达于细胞胞质[3]且在肺癌组织中有较高阳性率的耐药蛋白[4]。LRP的主要作用是清除外源性毒性物质，保护机体免受损害，其作用机制为：阻止以细胞核为靶点的药物进入细胞核，并将药物转运到细胞质的囊泡中，以胞吐的方式排出细胞[5]。在NSCLC组织中LRP阳性表达与肿瘤耐药[1]和预后不良密切相关[2]。国内学者[6]采用免疫组化法检测NSCLC组织，发现LRP表达率为67.1%。本研究证实LRP仅在NSCLC的胞质内表达，阳性率为66.1%，细胞核未见表达。与对照肺组织比较，LRP在NSCLC组织的表达明显升高(P<0.01)，在腺癌、鳞癌的表达均增高(P<0.01，P<0.05)。有学者[7]证实LRP在肺鳞癌中的表达强度低于腺癌，并认为其可能是临床上鳞癌较腺癌对化疗敏感、疗效较好的原因。本研究未能证实LRP高表达与NSCLC不同病理类型相关。有研究[6]发现LRP表达与组织学分级有关，即低分化者高表达，高分化者低表达；也有研究[7]提示LRP在中高分化癌组织中明显高于低分化者。本研究结果提示LRP在NSCLC不同病理分级间的表达无统计学差异(P>0.05)，因此推测肿瘤耐药与肿瘤分化程度无明显相关性。本研究还发现LRP的表达与性别、TNM分期、有无淋巴结转移及两年生存率均无关(P>0.05)，提示临床分期、有无淋巴结转移、患者性别等与NSCLC耐药无密切关系，与已有报道[7]一致。
肿瘤的生长和转移依赖于相关血管的生成。VEGF是最重要的血管生成因子，可刺激血管内皮细胞分裂、迁移而促进血管新生，也可增加血管通透性，刺激淋巴内皮细胞增生，促进肿瘤细胞转移[8]。本研究发现在NSCLC中VEGF表达明显增强(P<0.01)，在腺癌、鳞癌内的表达明显高于对照组(P<0.01)；TNM分期越晚VEGF阳性率越高(P<0.01)；有淋巴结转移的VEGF阳性率高于无淋巴结转移者(P<0.05)。但NSCLC中VEGF表达与病理类型、病理分级、性别及两年生存率等因素无关(P>0.05)。其中两年生存率的结果与MINEO等[9]的报道不同，可能与研究对象术后进一步干预以及样本量大小等因素有关。MVD是反映肿瘤血管的一个重要指标，是预测肿瘤转移和患者无病生存的重要因素[10]。本研究显示NSCLC包括鳞癌、腺癌组织的MVD明显高于对照(P<0.01)；MVD与TNM分期、淋巴结转移及两年存活状态有关，而与病理类型、病理分级、性别等因素无关(P>0.05)。结果证实VEGF表达与MVD一致，与已有研究结果[11-12]相同。
有研究发现VEGF表达与多药耐药蛋白(multi-drug resistance protein， MDR1)、LRP等表达相关[13]。血管生成抑制剂不但可抑制肿瘤血管的生成，还可在其诱导血管内皮细胞凋亡导致肿瘤细胞凋亡增加、耐药基因表达减少[14]，而LRP的过度表达与多种肿瘤耐药相关。本研究发现在NSCLC组织中LRP与VEGF表达呈正相关(P<0.05)，提示抑制NSCLC的VEGF可能会降低LRP的表达。本研究还证实NSCLC组织LRP、VEGF的表达增高与MVD增加相一致，据此我们推测LRP的高表达与VEGF上调其基因及VEGF促进肿瘤MVD增加有关。LRP、VEGF的高表达与MVD增加促进了肿瘤细胞的耐药、侵袭和迁移，导致病情进展，化疗失败。
综上所述，NSCLC血管生成与肺癌耐药具有一定的相关性。LRP的高表达可能与VEGF上调其基因及促进肿瘤MVD生成有关，因此VEGF不仅能诱导肿瘤血管生成促进肿瘤生长，还可能参与肿瘤耐药的形成。抑制肿瘤新生血管的生成将有望降低甚或遏制NSCLC的耐药性。LRP和肿瘤血管生成的机制将有待于进一步的深入研究。
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