作者：刘彦芳，秦莉，张达，韩彩娟
【摘要】 目的 探讨槲皮素(quercetin， QU)在大鼠角膜碱烧伤后抑制瘢痕形成的可能作用及其机制。方法 建立SD大鼠角膜碱烧伤模型，以右眼为实验眼。SD大鼠随机分为5组，对照组术后予眼膏基质，QU治疗组分别予2.5、5、10、20g/kg QU眼膏。术后裂隙灯显微镜检查，记录角膜混浊程度。于术后第4、7、14、21、28天处死动物，行组织学染色观察炎性细胞的浸润；Masson三色染色法观察角膜基质层胶原纤维的排列和增殖；免疫组织化学方法检测各组角膜组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)和转化生长因子-βⅠ受体(TGF-βRⅠ)的表达。结果 术后QU治疗组的角膜组织病理改变及角膜混浊程度较对照组轻，10g/kg QU和20g/kg QU组抑制角膜瘢痕形成作用强于2.5g/kg QU和5g/kg QU组，且10g/kg QU和20g/kg QU 组间比较无统计学差异。HE染色和Masson染色均显示QU治疗组角膜基质层胶原纤维的密度较对照组低。碱烧伤后第7天TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达达高峰，之后逐渐减少，接近正常水平；10g/kg QU和20g/kg QU 组抑制TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达作用强于2.5g/kg QU和5g/kg QU组，且10g/kg QU和20g/kg QU组间比较无统计学差异。结论 QU眼膏具有一定程度减轻瘢痕化的作用，尤以10g/kg浓度最佳。QU可能通过抑制TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达发挥其作用。
【关键词】 槲皮素；角膜；碱烧伤；转化生长因子-β1；转化生长因子-βⅠ受体
ChinaABSTRACT: Objective To explore the possible effect and mechanism of quercetin (QU) in inhibiting scar formation after the alkali burn of rats cornea. Methods We established corneal alkali-burn model on right eyes of the SD rats. The rats were pided into five groups randomly. The control group received blank ophthalmic gel; the QU treatment groups received 2.5， 5， 10， or 20g/kg quercetin ophthalmic gel， respectively. The rats were checked by slit-lamp microscope every day for the degree of corneal opacity， then were killed on day 4， 7， 14， 21 and 28 after operation. The infiltration of the inflammatory cells was observed by histology， the arrangement and proliferation of the collagen fibers in the corneal stroma were observed by Masson trichrome staining. The expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and receptor of transforming growth factor-βⅠ(TGF-βRⅠ) in cornea was observed by immunohistochemical method. Results The corneal opacity was less severe in the QU treatment groups than in the control group (P<0.05). Corneal scar was inhibited better in 10g/kg QU and 20g/kg QU groups than in 2.5g/kg and 5g/kg QU groups， and 10g/kg and 20g/kg QU groups had no significant differences (P>0.05). HE and Masson staining showed that the density of corneal stroma collagen fibers in the QU treatment groups was lower than that in the control group. The expression of TGF-β1 and TGF-βRⅠ reached the peak on day 7 after alkali burn， and then decreased slowly， which was close to the normal level. The expression of TGF-β1 and TGF-βRⅠ was inhibited better in 10g/kg and 20g/kg QU groups than in 2.5g/kg and 5g/kg groups， and 10g/kg and 20g/kg QU groups had no significant differences (P>0.05). Conclusion QU ophthalmic gel can
KEY WORDS: quercetin; cornea; alkali cauterization; transforming growth factor-β1; receptor of transforming growth factor-βⅠ
眼部碱烧伤是临床上一种严重的眼外伤，角膜瘢痕化是其重要的病理改变，也是致盲的主要原因。临床上缺乏治疗瘢痕化的有效药物。槲皮素(quercetin， QU)，化学名为3，4，5′，3′，4′-五羟基黄酮，是一种天然的黄酮类化合物，具有多种药理活性。近年来，国内外对槲皮素的研究日益增多，发现其具有抗肝脏、肾脏及瘢痕疙瘩纤维化的作用[1-3]。本实验通过建立SD大鼠角膜碱烧伤模型，研究QU抑制角膜瘢痕形成的可能作用及其机制，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 QU眼膏的制备[4]
取QU粉末(美国Sigma公司)适量置于灭菌乳钵中研磨成极细粉末，用9号筛筛除直径大于50μm的粒子，分别称取经筛选后的粉末50、100、200、400mg加入少量灭菌液体石蜡，继续研磨至糊状，然后加入灭菌眼膏基质(眼膏基质的组成为黄凡士林8份，液体石蜡1份，羊毛脂1份)至总重量达20g，研磨均匀即得质量浓度分别为2.5、5、10、20g/kg的QU眼膏。无菌软管分装，置4℃储存备用。
1.2 实验动物及分组
取雌性SD大鼠75只，体重180～220g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。将动物随机分为5组，每组15只，以右眼为实验眼，建立角膜碱烧伤模型。术后对照组予眼膏基质，QU治疗组分别予2.5、5、10、20g/kg QU眼膏。
1.3 模型制备
①用100g/L水合氯醛腹腔注射(0.3mL/100g)麻醉大鼠后，在裂隙灯显微镜下检查见大鼠角膜透明；②用4g/L的奥布卡因滴眼液滴眼2次，行表面麻醉，将直径为3.5mm圆形滤纸片(3.5mm角膜环钻钻取)浸入1mol/L氢氧化钠溶液内约60s，取出后用滤纸吸去过多碱液；③将滤纸片贴敷于右角膜中央，30s后取下，立即用生理盐水彻底冲洗烧伤区及结膜囊1min，涂红霉素及10g/kg硫酸阿托品眼膏预防感染及扩瞳预防虹膜后粘连；④伤后3d给予妥布霉素滴眼液滴眼，4次/d。继续常规饲养。
1.4 术后裂隙灯显微镜检查
术后每日在裂隙灯显微镜下观察眼前节情况，进行角膜混浊程度评分[5]。
1.5 组织学染色
分别于术后第4、7、14、21、28天处死大鼠，每组取3只大鼠(右眼)，迅速剜出眼球，于显微镜下剪取带1mm宽巩膜的角膜组织，轻轻剥除虹膜组织，将角膜置于40g/L多聚甲醛中固定，48h后取出，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，HE染色观察不同时间各组角膜组织炎性细胞的浸润。
1.6 Masson三色染色法观察胶原纤维
切片脱蜡至水，苏木素染5～10min后盐酸酒精分化，置丽春红品红酸性溶液中染色5～8min，蒸馏水冲洗，再用10g/L磷钼酸染1～3min，直接浸入苯胺蓝液中5min，迅速用水洗净，透明、中性树胶封片。
1.7 链酶亲和素免疫组织化学法(SABC法) 检测TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达
切片常规脱蜡下行水化。按SABC法步骤行免疫组织化学染色，一抗分别是1∶100的TGF-β1和TGF-βRⅠ，用PBS代替一抗作为阴性对照。实验所用抗体和SABC试剂盒均为武汉博士德公司产品。结果采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分析。在显微镜下(20×20)，每张切片随机测定5个视野的阳性染色密度，取其均值。
1.8 统计学分析
实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析。5组资料间的比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 裂隙灯显微镜观察结果
所有术眼均未出现严重感染征象。各组术眼均出现不同程度的结膜充血、角膜水肿等。 术后第28天，对照组角膜混浊明显，新生血管已到达角膜中央(图1)；10g/kg QU组角膜隐约可见淡淡的混浊，未见明显新生血管(图2)。角膜混浊程度评分结果显示，术后第28天，各组角膜混浊度评分有显著性差异(P<0.05)，5、10、20g/kg QU组评分明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；10、20g/kg QU组评分低于5 g/kg QU组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。表1 大鼠角膜碱烧伤后第28天角膜混浊程度评分比较（略）与对照组比较，*P<0.05；与5g/kg QU组比较，△P<0.05。
2.2 HE染色及Masson染色结果
术后第4天：对照组角膜肿胀明显，基质胶原纤维排列极其紊乱，可见大量炎性细胞浸润，成纤维细胞数量减少，角膜缘可见少量新生血管芽；2.5、5、10、20g/kg QU组角膜肿胀较对照组轻，10、20g/kg QU组角膜肿胀较2.5、5g/kg QU组轻，角膜基质胶原纤维排列较紊乱，可见中等量炎性细胞，角膜缘处未见明显新生血管芽。术后第7天：对照组角膜水肿较前有所减轻，基质胶原纤维排列紊乱，成纤维细胞数量有所增加，炎性细胞明显增多，新生血管从周边向中央延伸，浅基质层内可见较多新生血管；2.5、5、10、20g/kg QU组角膜肿胀较对照组轻，10、20g/kg QU组角膜肿胀较2.5、5g/kg QU组轻，角膜基质胶原纤维排列较紊乱，炎性细胞较前有所减少，角膜缘处可见少量细小的新生血管。术后第14天：对照组角膜水肿较前明显减轻，基质胶原纤维排列仍紊乱，成纤维细胞数量明显增加、体积增大，炎性细胞较前有所减少，新生血管已到达中央角膜，基质层内可见大量成熟新生血管，管壁由单层平滑肌构成，管腔粗大，内有成熟红细胞(图3)；2.5、5、10、20g/kg QU组角膜肿胀较对照组轻，10、20g/kg QU组角膜肿胀较2.5、5g/kg QU组轻，角膜基质排列趋于整齐，成纤维细胞数量明显减少，角膜浅基质层内可见少量新生血管，单层内皮细胞围绕形成新生毛细血管管腔(图4)。术后第21天：对照组角膜水肿已基本消退，基质胶原纤维排列仍紊乱，成纤维细胞数量减少，炎性细胞明显减少，角膜基质层内可见新生血管生长已基本稳定；10、20g/kg QU组角膜基质排列较2.5、5g/kg QU组整齐，角膜基质排列趋于整齐，基质细胞数量减少。术后第28天：对照组角膜基质胶原纤维排列仍紊乱，炎性细胞较前明显减少，基质层内新生血管生长已稳定；10、20g/kg QU组角膜基质排列较2.5、5g/kgQU组整齐，角膜基质排列趋于整齐，炎性细胞较前明显减少，成纤维细胞数量明显减少。
2.3 角膜组织中TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达
2.3.1 角膜组织中TGF-β1的表达
TGF-β1阳性表达于角膜的上皮层，特别是在角膜上皮层基底细胞的细胞质和细胞膜上以及基底膜上，呈棕色颗粒。术后第4天，各组角膜组织TGF-β1的表达明显增强，10、20g/kg QU组明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后第7天，各组角膜组织TGF-β1的表达达高峰(图5、图6)，10、20g/kg QU组明显低于对照组(P<0.05)；10、20g/kg QU组低于5g/kg QU组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后第14天，各组角膜组织TGF- β1的表达较前明显减少，10、20g/kg QU组低于对照组(P<0.05)；10、20g/kg组与5g/kg QU组比较明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。术后第21及28天，各组角膜组织TGF- β1的表达与之前相比明显减少，5、10、20g/kg QU组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；10、20g/kg 组与5g/kg QU 组比较，差异亦有统计学意义(P<0.05，表2)。表2 碱烧伤后角膜组织中TGF-β1的表达（略）与对照组比较，*P<0.05；与5g/kg QU组比较，△P<0.05。
2.3.2 角膜组织中TGF-βRⅠ的表达
TGF- βRⅠ阳性表达于角膜上皮细胞和角膜内皮的细胞膜，呈深黄色。术后第4天，各组角膜组织TGF- βRⅠ的表达明显增强，10、20g/kg QU组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后第7天，各组角膜组织TGF- βRⅠ的表达达高峰(图7、图8)，5、10、20g/kg QU组明显低于对照组(P<0.05)；10、20g/kg QU组低于5g/kg QU 组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后第14天，各组角膜组织TGF- βRⅠ的表达较前明显减少，5、10、20g/kg QU组与对照组比较，表达明显减少(P<0.05)；10、20g/kg QU组低于5g/kg QU 组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后第21及28天，各组角膜组织TGF- βRⅠ的表达较之前有所减少，10、20g/kg QU 组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；10、20g/kg QU组与5g/kg QU 组比较，差异亦有统计学意义(P<0.05，表3)。表3 碱烧伤后角膜组织中TGF- βRⅠ 的表达（略）与对照组比较，*P<0.05；与5g/kg QU组比较，△P<0.05。
3 讨 论
角膜前弹力层、基质层损伤后不能再生，而由不透明的纤维组织修复代替。各种角膜炎症、外伤损及前弹力层及其下的基质层，愈合后均会留下不同程度的瘢痕[6]。成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制、胶原的合成与降解失衡、大量细胞因子的产生是瘢痕形成的主要原因。瘢痕的防治也围绕上述机制展开。
本实验中，碱烧伤术后给予QU眼膏的角膜组织病理改变及角膜混浊程度较对照组轻，在2.5～10g/kg 浓度范围内，QU能时间、剂量依赖性地减轻角膜混浊程度，抑制角膜瘢痕形成；但是随着浓度的进一步增大，抑制作用却没有统计学差异。HE染色和Masson染色也证明了这一点。PHAN等[7]应用黄酮类化合物对体外培养的人成纤维细胞进行研究，证实了QU对成纤维细胞胶原网架的收缩有非常强烈的抑制作用。也就是说，QU不仅能够通过抑制胶原合成来抑制纤维化的发生，还可以通过抑制胶原网架的收缩减低纤维化的程度，这有利于减轻碱烧伤后角膜组织的胶原合成。
近年来，研究表明QU能够从抑制TGF-β和TGF-β受体的表达两个方面来阻断TGF-β的作用，从而减少成纤维细胞的增殖和胶原的合成，在抗纤维化中扮演重要的角色。毛咏秋等[8]研究得出槲皮素可抑制TGFβ1信号通路，包括抑制TGFβ1、纤维连接素(FN)表达及结缔组织生长因子(CTGF)基因的表达，具有潜在的抗肝纤维化治疗作用。PHAN等[9]将QU作用于瘢痕疙瘩中分离的成纤维细胞，通过免疫印迹法发现QU能够抑制TGF-βⅠ型受体和TGF-βⅡ型受体在成纤维细胞中的表达。
本实验观察到，术后第4天，各组角膜组织中TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达明显增加；术后第7天，各组角膜组织TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达达高峰，之后随着时间的延长，TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达逐渐减少，接近正常水平。由此可得出，在碱烧伤早期，即1周内对TGF-β1和TGF-βRⅠ进行干预调控是减少损伤后瘢痕形成的关键。同时，我们观察到在2.5 ～10g/kg浓度范围内，QU能时间、剂量依赖性地抑制TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达；但是随着浓度的进一步增大，抑制作用却没有统计学差异。因此，我们认为QU可抑制角膜成纤维细胞TGF-β1和TGF-βRⅠ的表达，以10g/kg QU眼膏的抑制效果最佳。提示QU抗纤维化的机制之一可能是抑制TGF-β1和TGF-βRⅠ蛋白表达，从而减少成纤维细胞的增殖和胶原的合成。
综上所述，槲皮素在角膜碱烧伤后抑制瘢痕形成方面有积极的作用，并且槲皮素具有广泛存在、易于获取、价格低廉、毒副作用低等特点。随着对其抗纤维化作用机制研究的不断深入，有望成为新一代抗纤维化药物运用于眼科临床。
参考文献
1]GUAN QH， PEI DS， LIU XM， et al. Neuroprotection against ischemic brain injury by SP600125 via suppressing the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis [J]. Brain Res， 2006， 1092(1):36-46.
[2]NEUMAR RW. Molecular mechanism of ischemic neuronal injury [J]. Ann Emerg Med， 2000， 36(5):483-506.
[3]CARDOSO CM， ALMEIDA LM， CUSTODIO JB. Protection of tamoxifen against oxidation of mitochondrial thiols and NAD(P)H underlying the permeability transition induced by prooxidants [J]. Chem Biol Interact， 2004， 148(3):149-161.
[4]范碧亭. 中药制剂学 [M]. 上海:上海科学技术出版社， 1997:311.
[5]JUN Y， DANAB MR， CHIE S， et al. Local suppression of IL-1 by receptor antagonist in the rat model of corneal alkali injury [J]. Exp Eye Res， 2003， 76(2):161-167.
[6]肖家翔. 角膜病中药局部外治研究进展 [J]. 中医药信息， 1995， 6:15-17.
[7]PHAN TT， LIM IJ， SUN L， et al. Quercetin inhibits fibronectin production by keloid-derived fibroblasts. Implication for thetreatment of excessive scars [J]. J Dermatol Sci， 2003， 33(3):192-194.
[8]毛咏秋，刘小菁，姜愚，等. 槲皮素对活化大鼠肝星状细胞TGF-β1信号的影响 [J]. 四川大学学报：医学版， 2004， 35(6):802-805.
[9]PHAN TT， LIM IJ， CHAN SY， et al. Suppression of transforming growth factor beta/smad signaling in keloid-derived fibroblasts by quercetin:implications for the treatment of excessive scars [J]. J Trauma， 2004， (57-5):1032-1037.