从系统生物学角度探讨细胞因子表达谱研究在V型狼疮性肾炎患者中的作用

　　　　 作者：孙吉平，尹爱萍，杨世峰，严俊飞

【摘要】 　　目的 探讨Th1和Th3细胞因子表达谱研究在V型疮性肾炎(VLN)患者中的作用。方法 分离血清，通过抗体芯片技术同时检测4种Th1和5种Th3细胞因子表达谱，并探讨其与临床指标之间的相关性。结果 ①细胞因子表达谱：在同时检测的9种细胞因子中，VLN患者有4种表达上调，除了IL2属于Th1细胞因子外，其他三种(IL4、IL10和IL13)均属于Th3细胞因子，其中IL10较健康对照升高了10倍以上。②相关性研究：Pearson相关分析显示IL10与SLIEDAI呈正相关、与血红蛋白浓度呈负相关；此外，IL4和IL13均与尿蛋白浓度呈负相关，IL1与血肌苷之间呈正相关。结论 VLN患者体内细胞因子表达异常以Th3细胞因子为主，提示抗Th3细胞因子可能在V型狼疮患者中具有一定的治疗作用。

【关键词】 狼疮性肾炎；细胞因子；免疫

　　ABSTRACT: Objective To study the effects of cytokines Th1 and Th3 in Class V lupus nephritis (VLN). Methods Serum concentration of Th1 cytokines (IFNγ， IL1， IL2 and TNFα) and Th3 cytokines (IL4， IL5， IL6， IL10 and IL13) were simultaneously analyzed using fast quant human Th1/Th3 protein array， and Pearson analysis was used to evaluate the association between cytokines and clinical parameters. Results ① Cytokine profiling: Among the 9 cytokines detected simultaneously by fast quant human Th1/Th3 protein array， the expression of four cytokines was upregulated obviously， namely， Th1 cytokines (IL2) and Th3 cytokines (IL4， IL10 and IL13); that of IL10 was 10 times above the normal control. ② Pearson correlation analysis: There was a positive correlation between IL10 and SLEDAI (r=0.877， P<0.01)， but a negative correlation between IL10 and hemoglobin concentration (r=-0.856， P<0.01). There was also a negative correlation between IL4 and 24h urine protein (r=-0.754， P<0.05)， between IL13 and 24h urine protein (r=-0.769， P<0.05). Besides， IL1 and creatinine were positively correlated (r=0.784， P<0.05). Conclusion There were extensively abnormal Th3 cytokines in VLN patients， suggesting that antiTh3 therapy may produce a marked effect on VLN.

　　KEY WORDS: lupus nephritis; cytokine; immunity

　　系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus， SLE) 是一种T细胞介导的、自身反应性B细胞高度增生、大量高亲和力的致病性的自身抗体产生的自身免疫性疾病[1]。狼疮性肾炎(lupus nephritis， LN)是SLE患者较常见的最严重的并发症和死亡的主要原因之一[2]。LN患者病程反复，伴有进展性的组织病变，疾病的死亡率居高不下，目前主要是通过应用非特异性免疫抑制剂和进行抗炎治疗。如果能了解SLE导致肾损伤的发病机制，发现新型的低毒性治疗方法，会更好的进行特异性的治疗，改善狼疮性肾炎患者的预后。

　　伴随着免疫细胞的数量和功能上的异常，细胞因子网络的变化对LN病程的演进有重要的作用：Th1型和Th3型细胞因子比例失调、细胞因子水平分泌增加或减少、细胞因子间相互的拮抗或协同作用增强或减弱等都参与了LN的发病过程[3]。但是，LN属于一种以肾脏形态学异常为基础的临床综合征，而且LN发病机制十分复杂，同一个患者可以同时存在多种细胞因子的异常，不能孤立的看待某一种细胞因子的异常，而多种细胞因子间的相互作用可能更为重要。因此，本实验以V型LN患者为基础，通过系统生物学的研究方法，借助高通量的抗体芯片技术同时观察V型LN患者血清多种细胞因子(包括Th1细胞因子和Th3细胞因子)的变化，以期从免疫学网络失衡角度阐明LN可能的发病机制，为治疗奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例选择

　　按照1982年美国风湿病协会SLE的诊断标准[4]选择狼疮性肾炎患者20例，均为女性，具有肾脏累及的临床表现；均进行肾活检。根据1985年WHO改良病理分型标准进行分型诊断符合弥漫膜性肾炎(V型)，根据SLEDAI评分(SLE Disease Activity Index)标准判断LN患者肾活检时疾病活动情况[5]，所有患者3月内未使用霉酚酸酯(MMF)或环磷酰胺(CTX)等强免疫抑制剂治疗。同时选择年龄和性别匹配的健康志愿者20例作为正常对照。

　　1.2 血清细胞因子检测

　　清晨抽取空腹静脉血5mL，离心后留取血清，-70℃保存待测。血清细胞因子的检测采用德国Whatman公司提供的抗体芯片，同时定量检测9种细胞因子的表达，其中包括4种Th1细胞因子IL1(白细胞介素1)、IL2(白细胞介素2)、IFNγ(γ干扰素)、TNFα(肿瘤坏死因子α)和5种Th3细胞因子IL4(白细胞介素4)、IL5(白细胞介素5)、IL6(白细胞介素6)、IL10(白细胞介素10)、IL13(白细胞介素13)的表达。每个因子检测设立3个复孔，取平均值。具体操作简述如下：玻片装上孵育室并将玻片/孵育室一起装入玻片夹；70μL封闭液室温封闭15min；常温孵育样品过夜(轻微振荡)；洗涤5次；生物素标记的抗体室温孵育60min(轻微振荡)；洗涤5次；StreptavidinCy5室温孵育45min(轻微振荡)；洗涤5次；Dih3O冲洗玻片并干燥；扫描玻片，进行资料分析。

　　1.3 其他实验室检查

　　所有患者同时进行以下检查：①24h尿蛋白定量：采用双缩脲比色法，正常值＜0.4g/24h；②自身抗体：抗核抗体(ANA)采用间接免疫荧光法，抗双链DNA(dsDNA)采用短膜虫法；③补体C3、C4：采用散射比浊法。

　　1.4 统计学方法

　　结果以均数±标准差表示。组间差异采用Students t检验，并通过Pearson相关性分析研究细胞因子表达及淋巴细胞亚群与临床指标之间的相关性。以P<0.05为具有统计学差异。

　　2 结 果

　　2.1 患者的临床实验室的相关检查

　　V型LN患者一般临床资料见表1。V型LN患者白细胞、血红蛋白、补体C3和C4均明显低于健康对照组。与健康对照相比，白细胞计数分别为(5.015±1.426)×109/L和(6.271±2.730)×109/L(P<0.05)；血红蛋白分别为(118.3±21.1)g/L和(124.3±6.1)g/L(P<0.05)；补体C3分别为(0.432±0.023)g/L和(0.620±0.223)g/L(P<0.05)；C4分别为(0.089±0.041)g/L和(0.111±0.041)g/L(P<0.05)。但是，尽管与健康对照组相比，V型狼疮性肾炎患者CD3+细胞比率无明显变化[与健康对照组分别为(69.3±8.92)%和(72.8±6.93)%]，但计数明显降低，与健康对照组分别为(989±342)/μL和(1342±425)/μL(P<0.05)；CD4+细胞比率和计数均较健康对照组显著下降，但CD8+细胞与健康对照组无明显改变。因此，出现CD4+/CD8+比值倒置[与健康对照组分别为(1.05±0.38)和(1.55±0.57)，P<0.05]；CD20+细胞比率及计数均明显高于健康对照组[比率分别为(18.2±7.04)%和(12.1±4.01)%，P<0.05；计数分别为(257±69)%和(145±69)%，P<0.05]，提示VLN患者存在明显的细胞免疫功能紊乱。表1 V型狼疮性肾炎患者的临床实验室的相关检查（略）

　　2.2 血清细胞因子的表达谱

　　V型LN患者所检测的9种细胞因子中有4种较对照组升高，除IL2属Th1细胞因子外(P<0.05)，其他3种细胞因子均为Th3细胞因子，包括IL4(P<0.01)、IL10(P<0.01)和IL13(P<0.01，表2)。
　　
　　为明确细胞因子增长情况，我们以健康对照组细胞因子平均值为基数，观察了每种细胞因子增长幅度，发现V型LN患者升高最明显的细胞因子是IL10，较对照组升高了10倍以上，其他几种细胞因子增高幅度均在3～5倍之间，提示在LN中存在明显的细胞因子的比例失衡，细胞因子网络之间的平衡被打破，表现为细胞因子上调幅度不均一。表2 V型狼疮性肾炎和健康对照组Th1、Th3细胞因子浓度的变化（略）

　　2.3 相关性研究

　　Pearson相关分析显示，主要是Th3细胞因子与临床表现之间存在明显的相关性，尤其是IL10，如IL10与SLIEDAI呈正相关(r=0.877，P<0.01)、与血红蛋白浓度呈负相关(r＝-0.856，P<0.01)；其他Th3细胞因子，如IL4和IL13均与尿蛋白浓度呈负相关(r分别为-0.754和-0.769，P<0.05)。Th1细胞因子中仅IL1与血肌苷水平之间呈正相关(r=0.784，P<0.05)。

　　3 讨 论

　　LN是我国最常见的继发性肾小球肾炎，其临床和肾脏病理改变存在显著的不均一性和多样性，不同的病理类型不仅反应了形态学上的差异，更可能蕴含不同的发病机制。V型病变表现为膜性病变，以上皮侧免疫复合物沉积和补体沉积为主要特征，临床上以大量蛋白尿为突出表现，但其发病机制尚未完全阐明。

　　如前所述，细胞因子参与免疫反应的每一个环节。细胞因子网络中，Th1/Th3细胞因子的失衡尤为受到研究者的关注，目前有Th3优势、Th1优势以及Th1向Th3转化发展的优势等[6]不同的假说。但是，Th1/Th3各代表了一组细胞因子，如果能同时检测多种细胞因子表达，将对研究细胞因子失衡在LN中的作用具有重要意义。抗体芯片可以一次性的检测上百上千种蛋白质的表达丰度，具有特异性强，敏感性高，检测范围广等优势。因此，本实验采用系统生物学的研究方法，通过高通量的抗体芯片技术对V型LN患者体内9种细胞因子(包括Th1和Th3细胞因子)同时进行分析，以便全面了解V型LN患者体内细胞因子的表达情况。

　　本实验首先对细胞因子表达进行综合分析，发现所检测的9种细胞因子有4种明显升高，包括一种Th1细胞因子和3种Th3细胞因子。但是，增长幅度显著不同，以Th3细胞因子增长最明显，其中IL10增加最显著，较健康对照组升高10倍以上，提示VLN患者体内细胞因子表达平衡被打破。作为Th3细胞因子的代表， IL10 在SLE 体液免疫激活和自身抗体产生中有不可忽视的促进作用。已有研究发现，IL10基因多态性不仅与LN 全身活动性相关，还对肾脏的临床活动和免疫病理损害产生影响[7]。自身抗体的产生是SLE发病机制中的关键因素，与其相应的自身成分结合成循环免疫复合物在机体各处沉积，激活补体系统，引发炎症反应，造成广泛的组织损伤[89]。作为B细胞活化和增殖的促进因子，IL10血清水平的升高恰好可以解释LN患者免疫系统的功能失调。

　　目前，关于细胞因子与LN疾病的相关性研究主要集中于细胞因子与狼疮疾病活动性指数、自身抗体之间的相关性上。但是，在此方面却存在较大争议。例如，RAPLEY等报道IL6水平与SLE活动性相关[10]，WAIS却认为IL6与SLE活动性无相关性[11]；作为一种Th1细胞因子，IFNγ在SLE发病机制中具有重要作用[12]，而在本研究中发现VLN型患者体内IFNγ无明显改变，考虑与患者入选标准不同、细胞因子检测方法不同有关。本实验中发现主要是Th3细胞因子与临床表现之间存在相关性。例如，IL10与SLEDAI呈正相关，与血红蛋白浓度呈负相关；IL4和IL13均与尿蛋白浓度呈负相关，提示Th3细胞因子可能参与肾脏疾病进展。但是，本研究主要选择未经过强免疫抑制剂治疗的患者，如果能增加部分活动性相对较弱的病例，或对入选患者进行免疫抑制剂治疗后做纵向对比分析，可能会提供更有意义的数据，可通过治疗前后细胞因子的变化判断LN治疗的效果，即细胞因子可能成为判断LN病情及治疗效果的生物学标记物。

　　狼疮性肾炎是发病机制复杂的异质性疾病，不仅淋巴细胞参与其中[13]，复杂的细胞因子免疫调控网络，及其受体间平衡紊乱也可能参与狼疮性肾炎的发生、发展。本研究发现V型狼疮性肾炎患者体内存在广泛的淋巴细胞异常及细胞因子表达谱异常，提示显著的免疫功能紊乱。这可能是目前免疫抑制剂治疗狼疮性肾炎的基础。但是，本课题仅限于未经强免疫抑制剂治疗的患者，如果能增加部分治疗后的随访观察结果，可能会对狼疮性肾炎的免疫学发病机制及免疫抑制剂的治疗机制提供进一步的理论基础。

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