肾清饮对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其可能的机制

　　　　　　作者：郝亚宁，赵丽娟，尹爱萍，杨世锋，严俊飞

【摘要】 　　目的 探讨肾清饮对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及可能的机制。方法 40只链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠随机分成模型组、肾清饮组、贝那普利组和肾清饮联合贝那普利组，连续给药8周后观察血糖、肾功能和24h尿蛋白定量的变化，分别检测肾组织及尿中丙二醛(MDA)含量，肾组织中超氧化物岐化酶(SOD)的活性，血清转化生长因子(TGFβ1)水平的变化，光镜观察肾脏病理形态学的改变。结果 各药物组肾功能明显改善，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，但对血糖无明显改善作用，24h尿蛋白量较模型组显著下降(P<0.05或 P<0.01)，联合组下降最为显著(P<0.01)；各药物组肾组织及尿MDA含量、肾组织SOD活性和血清TGFβ1表达与模型组有显著性差异(P<0.05或 P<0.01)，联合组与其他药物组比较差异显著(P<0.05)。光镜观察各药物组肾脏病理改变均有不同程度改善，各组间无明显差异。结论 肾清饮对糖尿病大鼠肾脏有保护作用，与贝那普利联用有协同作用。其作用机制可能与抑制氧化应激和增强机体抗氧化能力，降低炎症因子TGFβ1的表达有关。

【关键词】 肾清饮；糖尿病肾病；超氧化物岐化酶；丙二醛；转化生长因子β1
　　ABSTRACT: Objective To investigate the possible protective effect of Shenqingyin Decoction on the kidney of experimental diabetic rats and its possible mechanism. Methods Totally 40 rats with diabetes induced by streptozocin were pided into 4 groups: diabetes model group， Shenqingyin group， Benopril group and ShenqingyinBenopril combination group. After 8 weeks' treatment， blood glucose， renal function and 24h urine protein were measured， and malondialdehyde (MDA) in renal tissues and urine， superoxide diamutase (SOD) activity and serum transformed growth factorβ1(TGFβ1) were tested; renal pathological changes were observed with light microscope as well. Results The serum BUN， Scre of all medicine groups were significantly improved， which did not significantly differ from that in control group (P>0.05). However， it had no obvious improving effect on blood sugar. The content of 24h urine protein in all medicine groups was significantly lower than that in model group (P<0.05 or P<0.01)， and ShenqingyinBenopril combination group had the significantly lower level than the other two medicine groups (P<0.01). MDA in renal tissues and urine， SOD activity and serum TGFβ1 in all medicine groups significantly differed from those in the model group (P<0.05 or P<0.01)， and ShenqingyinBenopril combination group had obvious difference with the other two medicine groups (P<0.01). Light microscopy showed amelioration of different degree in renal pathological changes， but with no significant differences in all medicine groups. Conclusion Shenqingyin Decoction has a protective effect on the kidney of experimental diabetic rats， and it has some synergetic effect when combined with Benopril. The mechanism may be related to inhibiting oxidative stress， improving the bodys antioxidant ability and decreasing the expression of inflammatory factor TGFβ1.

　　KEY WORDS: Shenqingyin Decoction;diabetic nephropathy; superoxide diamutase (SOD); malondialdehyde (MDA); transformed growth factorβ1 (TGFβ1)

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy， DN)是糖尿病常见的并发症，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。糖尿病导致的肾脏损害几乎可累及肾脏的所有结构，从肾小球、肾小管到肾间质和血管。DN作为糖尿病这一代谢性疾病所致全身微血管并发症之一，不仅在临床表现和疾病进程方面有别于其他免疫介导的肾脏疾病，而且一旦出现肾功能损害，其进展速度亦远快于非DN患者。因此，预防和延缓DN的发生和发展，对提高糖尿病患者的存活率，改善其生活质量具有十分重要的意义。中医药对DN的防治研究是其一个重要的方面。我们以往的研究显示中药复方肾清饮可通过减少肾组织Ⅰ型胶原的沉积、降低血浆内皮素的含量和肾组织转化生长因子(transformed growth factorβ1， TGFβ1)的表达而起到防治肾间质纤维化，保护肾功能的作用[1]。临床应用肾清饮治疗糖尿病肾病亦取得一定疗效。本实验通过链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病模型，旨在从实验角度探讨肾清饮对糖尿病大鼠肾脏的保护作用，并从氧化应激及细胞因子表达的变化等方面探讨其作用的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及模型的建立

　　雄性SD大鼠50只，体重150～200g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供[实验动物生产许可证号：SCXK(陕)2007001]。设置正常对照组10只，给予普通饲料。其余40只参照文献[2]方法建立DN模型，给予高糖、高脂、高胆固醇饲料喂养，4周后随机抽取高糖高脂组10只，正常对照组4只，心脏采血检测血清胰岛素含量(125I胰岛素放免分析药盒系北京北方生物技术研究所产品)，根据检测结果判断造模大鼠已经产生胰岛素抵抗。禁食过夜，按45mg/kg体重的剂量，给予高糖高脂组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin， STZ， Sigma公司产品)柠檬酸溶液。72h后将尾静脉全血血糖≥16.5mmol/L作为糖尿病模型造模成功的标准。正常对照组大鼠仅一次性腹腔注射等量的柠檬酸盐缓冲液(假造模)，并在假造模后采用相同方法测定血糖。

　　1.2 分组及给药

　　32只造模成功大鼠随机分为4组，每组8只。其中肾清饮组给予肾清饮(由黄芪、地龙、当归、川芎、红花、桃仁、芍药、炙大黄等组成，由本院药剂科提供饮片并煎制浓缩)浓缩药液灌养[15g/(kg·d)]，贝那普利组给予贝那普利(每片10mg，诺华制药公司产品)混悬液灌养[10mg/(kg·d)]，肾清饮联合贝那普利组按单药物组剂量给药；对照组和模型组给予等量蒸馏水灌养。每日1次，连续给药8周。

　　1.3 样品的收集

　　用药期间观察大鼠一般状况包括精神状态、行为、毛色、尿量、饮水量的变化，每周称量体重。8周时代谢笼收集24h尿液，待测24h尿蛋白及尿丙二醛含量。水合氯醛麻醉后大鼠心脏采血以测定血糖、血肌酐及尿素氮、TGFβ1含量。取双肾，去包膜，灌洗称重，右肾皮质以100mL/L甲醛固定，48h后逐级酒精脱水、石蜡包埋，切片4μm，常规HE和Masson染色，光镜下观察其病理学改变。左肾皮质在冰浴条件下，用冷生理盐水制备成100mL/L的匀浆液，保存于-20℃冰箱中。

　　1.4 测定指标

　　血糖(BG)采用罗氏公司血糖仪测定，血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)和24h尿蛋白(UPRO/24h)采用日本OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪测定。

　　丙二醛(malondiadehyde， MDA)含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)检测，肾组织中超氧化物岐化酶(superoxide diamutase， SOD)活性检测采用上海产TG328电光分析天平，试剂盒均系南京建成生物工程研究所产品；采用酶联免疫吸附法检测血清转化生长因子水平的变化，试剂盒系比利时Bicsource公司产品。以上测定步骤严格按照试剂盒说明书进行。

　　1.5 统计学处理

　　所有数据以(±s)和(M)表示，应用SPSS16.0软件包进行统计分析，数据符合正态方差齐性时组间比较采用单因素方差分析，当不符合条件时，采用秩和检验，且在两两比较时，校正检验水准。检验水准在方差分析时取0.05，秩和检验根据两两比较的次数加以校正。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠一般状况的比较

　　造模后模型组大鼠逐渐出现毛发枯黄、精神萎靡、反应迟钝、尾巴苍白湿冷以及多饮、多食、多尿等症状，体型亦由原来的胖大转为明显瘦小，期间死亡2只。药物组大鼠第1周至第3周与模型组表现相似，期间死亡4只，用药1个月后，各治疗组大鼠精神好转，进食量逐渐正常，饮水量、尿量也随之正常。与模型组比较毛色明显转好，体重增加，自发活动亦明显改善。而正常对照组大鼠精神良好、活动频繁、毛发纯白光泽、饮水量及尿量均正常。

　　2.2 各组大鼠生化指标的比较

　　模型组及3个药物组大鼠第8周实验结束时血糖均明显高于对照组(P<0.01)，各药物组间无统计学差异；模型组血尿素氮、肌酐及24h尿蛋白明显高于对照组(P<0.01)，各治疗组尿素氮、肌酐较模型组显著下降(P<0.05或 P<0.01)，与对照组无明显差异(P>0.05)，肾清饮及肾清饮联合贝那普利组更为显著(P<0.01)。肾清饮联合贝那普利组24h尿蛋白定量虽仍高于对照组(P<0.01)，但较其他药物组下降明显(P<0.01，表1)。表1 各组大鼠生化指标的比较（略）

　　2.3 各组大鼠肾脏组织MDA及尿MDA含量的比较

　　模型组肾组织及尿MDA含量明显高于对照组(P<0.01)，各药物治疗组肾组织及尿MDA含量低于模型组，且差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)，但仍高于对照组(P<0.01)。肾清饮组和贝那普利组尿MDA含量仍高于肾清饮联合贝那普利组(P<0.01)，即治疗后肾清饮联合贝那普利组尿MDA减少最为明显(表2)。表2 各组大鼠肾脏组织MDA及尿MDA含量的比较（略）

　　2.4 各组大鼠肾脏组织SOD活性和血清TGFβ1含量的比较

　　模型组SOD活性明显低于对照组(P<0.01)，各药物治疗组SOD活性高于模型组，差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)，其中肾清饮联合贝那普利组SOD活性与对照组相比差异无显著性(P>0.05)；模型组大鼠血清TGFβ1水平明显高于对照组(P<0.01)，各药物治疗组TGFβ1水平明显低于模型组，差异具有显著性(P<0.01)，其中贝那普利组和肾清饮联合贝那普利组TGFβ1与对照组差异无显著性(P>0.05)，肾清饮组TGFβ1 高于肾清饮联合贝那普利组(P<0.05，表3)。表3 各组大鼠肾脏组织SOD活性和血清TGFβ1含量的比较（略）

　　2.5 大鼠肾组织的形态学变化

　　光镜观察对照组肾小球结构完整，无小球横截面面积增大，肾间质无异常；糖尿病模型组未见到肾小球弥漫性硬化及结节性硬化的典型改变，但肾小球稍增大，毛细血管内皮细胞增多，肾小球系膜细胞呈中度增生，毛细血管基底膜增厚，系膜区增宽。各药物组肾小球较糖尿病模型组病变有所减轻。Masson染色可见模型组肾小球、肾间质基质有明显沉积，而各药物组未见到上述变化，与对照组无明显差别(图1)。

　　3 讨 论

　　较多研究资料表明，高糖、高脂膳食可成功制备胰岛素抵抗大鼠模型。在类似胰岛素抵抗大鼠的基础上加腹腔注射STZ诱导2型糖尿病肾病模型，肾脏随之而来的损害与时间成正比，且病理生理比较符合人类2型糖尿病肾病的特点，所以更适合用于DN早期防治措施的研究[3]。本实验采用此方法制备的动物模型生化指标与对照组有明显差异，但肾脏病理未见到肾小球弥漫性硬化及结节性硬化的典型改变，而仅见轻度的病理损害，也符合DN的早期研究。DN是糖尿病微血管病变的重要表现形式之一。高血糖及由此而导致的继发性代谢紊乱在DN的发病中起着关键的作用。血流动力学因素单独或与代谢因素一起激活肾内第二信使系统及氧化应激过程等。这些途径最终导致肾小球高滤过、高灌注、高压力状态，使白蛋白漏出增加、肾小球基底膜增厚和以肾小球系膜区为主的细胞外基质聚集，从而引起肾小球硬化和小管间质纤维化，促发DN。

　　中医学对DN没有专门的论述，根据其发病特点等可归属于中医“消渴”及“水肿病”范畴。对其病因病机比较一致的看法是：血瘀证随糖尿病病程之迁延而上升，是DN发生的根源，气虚血瘀是DN贯穿始末的病理变化。现代研究发现DN中的微血管病变与DN有血瘀症者均有明显的血液高凝倾向[45]。用益气活血法既能补气行气又能活血化淤，从而达到治疗的目的。补阳还五汤乃益气活血，改善血流动力学的代表方剂[6]，出自清代王清任所著的《医林改错》，肾清饮是在该方基础上化裁而成，主要组成有黄芪、地龙、当归、川芎、桃仁、红花、生熟地、炙大黄等，起到活血化淤、益气补肾的功效。方中黄芪甘温，温阳益气，利水消肿，现代药理研究亦表明黄芪、当归可通过减少蛋白尿排泄、调节血脂和水钠代谢、减少人肾系膜细胞的增殖和IV型胶原的生成等作用，延缓慢性肾病向肾硬化进展[7]。另外，黄芪可通过降低脂质过氧化物的含量、提高超氧化物歧化酶的活性，从而减轻氧自由基对肾脏微血管的损伤[8]。大黄具有泻热通便，活血化瘀，凉血解毒的功效。现代研究显示，大黄酸可从多个方面防治DN的发生和发展[9]。本实验显示肾清饮与贝那普利对DN 大鼠的肾功能、24h尿蛋白和肾脏的病理改变均有明显的改善作用，二者联合作用更为明显。提示肾清饮对DN的肾脏保护作用，与众多研究证明的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)贝那普利对DN的 保护作用相当[10]，二者联合应用可加强这种保护效应。但是，对大鼠血糖无明显改善作用。提示在DN的防治中血糖控制需应用降糖药物。
　　
　　在DN的发生和发展过程中，氧化应激所产生的过多机体反应性氧(reactive oxygen species， ROS)在糖尿病血管并发症中扮演首要和关键角色[1112]。ROS在肾系膜细胞中介导高糖和TGFβ1引起的PAI1mRNA及蛋白的表达和纤维蛋白溶酶活性的降低，进而使细胞外基质(ECM)沉积增多，参与DN上皮细胞间质转化而导致的肾小管间质纤维化。本实验通过测定氧化应激指标脂质过氧化产物MDA和机体清除体内超氧阴离子自由基的重要生物酶SOD，显示肾清饮、贝那普利均可减少DN大鼠肾组织和尿中MDA的表达，并提高肾组织中SOD的活性，二者联合作用更为显著。提示无论中药肾清饮还是ACEI类贝那普利均可降低高糖引起的氧化应激反应，减轻肾脏损害，从而达到保护肾脏的作用，贝那普利的作用与文献报道相一致[1314]。在DN的发生和发展过程中，肾小球血流动力学改变、细胞外基质代谢、细胞增殖和细胞肥大等诸多方面，均有细胞因子的参与。TGFβ1是介导DN发生、发展最核心的细胞因子，可通过调节细胞增殖、分化和凋亡，介导肾脏胶原的沉积等途径而发挥作用[15]。本实验显示DN大鼠血清TGFβ1在模型组较正常对照组表达明显上升，与文献报道相一致；用药治疗8周后，各药物组的TGFβ1表达均有降低，肾清饮与贝那普利作用相当，二者联合能更大程度地抑制TGFβ1的产生。

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