溃疡性结肠炎大鼠血清酪酪肽水平及其受体特性的测定

　　　　 作者：潘淑波，刘欣，龚均，董蕾，王景林

【摘要】 　　目的 通过测定溃疡性结肠炎(UC)大鼠血清酪酪肽(PYY)水平及其空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的特性来观察UC时血清PYY水平及其受体的变化。方法 将大鼠随机分成UC组、腹泻型肠易激综合征(DIBS)组及对照组，用同位素放射免疫法分别检测各组的PYY水平及反映受体特性的两个参数：平衡解离常数(Kd)和最大结合容量值(Bmax)。结果 UC及DIBS组血清PYY水平高于对照组(P<0.001)，且UC组亦高于DIBS组(P<0.001)；但UC组Kd及Bmax值与正常组和DIBS组比较均无明显差异(P>0.05)。结论 UC组PYY水平高于正常及DIBS组，推测UC时PYY水平的变化可能与其腹泻症状和炎症病变的产生有关；UC组的Kd及Bmax与正常组比较无显著变化，推测UC可能与PYY受体的变化无关。

【关键词】 溃疡性结肠炎；胃肠激素；酪酪肽；酪酪肽受体

　　ABSTRACT: Objective To observe the changes of peptide YY (PYY) and its receptors in rats with ulcerative colitis (UC) by detecting both the serum level of PYY and jejunum epithelial cells in UC rats. Methods Rats were randomly pided into UC group， diarrheairritable bowel syndrome (DIBS) group and control group. We measured the serum level of PYY by radioimmunoassay and made radioligand analysis of two basic parameters reflecting the characteristics of PYY receptors: dissociation constant (Kd) and maximum binding capacity (Bmax). Results The serum level of PYY was higher in UC and DIBS groups than in normal group (P<0.001)， and it was higher in UC group than in DIBS group (P<0.001). However， the values of Kd and Bmax in UC group did not differ significantly from those in DIBS and normal groups (P>0.05). Conclusion The serum level of PYY in UC group was significantly higher than that in normal group and DIBS group; therefore， we assume that the change of serum PYY level may be related to not only the symptom of diarrhea but also inflammation. Kd and Bmax in neither UC group nor DIBS group were significantly different from those in normal group， which indicates that the symptom and inflammation in UC may have nothing to do with the changes of PYY receptors.

　　KEY WORDS: ulcerative colitis (UC); gut hormone; peptide; peptide receptor (PYY)

　　溃疡性结肠炎(ulcerative colitis， UC)为一种慢性结肠、直肠炎性疾病，又称非特异性溃疡性结肠炎，可发生于各年龄段，并与结肠癌发病相关。近年来，在我国报告的病例明显增加，国内推算的患病率为11.6/10万[1]，已成为常见的肠道疾病和慢性腹泻的主要病因。但是，其病因和发病机制至今仍不清楚，认为可能与遗传因素、细菌的感染、机体免疫反应、环境因素及精神因素有关[2]。酪酪肽(peptide YY， PYY)是近年发现的一种新的胃肠激素，其对于消化道的生理功能有多种重要调节作用，包括抑制胃肠蠕动[3]及肠黏膜的分泌[4]，抑制胆囊收缩[5]，刺激肠上皮增生[6]，抑制胰腺外分泌[7]等。本课题通过测定UC大鼠的血清PYY水平及其空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的平衡解离常数(dissociation constant， Kd)和最大结合容量值(maximum binding capacity， Bmax)，来观察UC大鼠的PYY水平及其受体变化与疾病之间的关系，从而进一步探讨UC的发病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　清洁级SD大鼠，雄性，体重200～280g，由西安交通大学实验动物中心提供。

　　1.2 主要仪器、药品与试剂

　　紫外分光光度计UV260 SHIMADZU(日本)；FM200010γ免疫计数器(西安凯普机电有限责任公司)；PYY放免试剂盒，PYY，125IPYY比活度2200Ci/mmol以及50mL/L 2，4，6三硝基苯磺酸(TNBS)均购于SIGMA公司；考马斯亮蓝蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　1.3 实验动物的分组

　　按照随机分配的原则将实验动物分成三组，即UC组、腹泻型肠易激综合征(diarrheairritable bowel syndrome， DIBS)模型大鼠组和正常对照组， 每组各10只。

　　1.4 模型的建立

　　①UC大鼠模型的制备[8]：用50mL/L三硝基苯磺酸(TNBS)与无水乙醇以体积1∶1配成25g(TNBS)/L的混合液；实验前禁食24h，乙醚吸入麻醉后经肛门插入硅胶管(距肛门8cm)，按相应体重比例灌入配好的混合液(100mg/kg)，然后再注入一段空气，用手压迫肛门并将大鼠尾巴抬高30s，造模后大鼠仰卧归笼，同时每天观察大鼠的情况。根据文献[8]，UC组大鼠在第7天结肠长度缩短及溃疡分数增加程度最为明显，遂于造模第7天处死大鼠，剖取距肛门5～9cm结肠段，沿纵轴剪开，冰生理盐水反复冲洗后，可发现明显的溃疡形成。②阳性对照(DIBS模型大鼠)的制备[910]：实验前12h禁食，实验第1天给大鼠称重，乙醚吸入麻醉后经肛门插入硅胶管(距肛门8cm)，结肠内灌入40mL/L的乙酸1mL。缓慢拔出硅胶管，用手压迫肛门并将大鼠尾巴抬高30s，然后用生理盐水冲洗结肠。恢复6d。根据文献[10]乙酸灌肠后第7天结肠组织学恢复正常，但大鼠对结、直肠扩张刺激的敏感性仍持续增高，遂于实验第7天行束缚应激3h。收集应激期3h内的大鼠粪便，与正常大鼠比较，若粪粒数、粪便湿重和粪便含水量较对照组增多，表明造模成功。③正常对照组：置于安静环境中喂养，自由饮水，摄食，第7天处死大鼠。

　　1.5 血清PYY激素水平的测定

　　处死各组大鼠前分别采其腹主动脉血，离心后获得血清，用同位素放射免疫法检测各组大鼠血清内的PYY激素水平。

　　1.6 大鼠空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的测定

　　①按

参考文献

[1112]制备大鼠空肠黏膜上皮细胞膜标本；②用考马斯亮蓝法测定大鼠空肠黏膜上皮细胞膜蛋白的浓度；③受体放射配基结合分析方法测定大鼠空肠黏膜PYY受体：模型组和对照组分别设定反应管和对照管两组，每组设10个反应浓度；两组均加入已测定蛋白浓度的细胞膜液；反应管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L～1μmol/L)依次加入后，再加入0.05nmol/L125IPYY；对照管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L～1μmol/L)依次加入后，均再加入0.1μmol/L浓度PYY，0.05nmol/L 125IPYY；充分混合后，15℃温孵2h后，加入冰冷HEPES缓冲液终止反应；2000g离心，弃去上清液，将沉淀进行γ计数。空肠黏膜富含酶类物质，加入杆菌肽抑制酶类破坏受体。反应管为总结合，对照管为非特异结合，受体的特异结合=总结合-非特异结合。将得到的PYY受体特异结合数值换算成特异结合百分率(specific binding， %)做纵坐标，以非标记配体浓度的对数值(Log mol/L)做横坐标，应用Excel制图软件得到竞争抑制曲线，应用公式计算Kd及Bmax。

　　1.7 统计学分析

　　采用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(±s)表示，显著性检验采用多组单因素方差分析，检验水准为0.05。

　　2 结果

　　2.1 DIBS组与对照组的排便情况

　　DIBS组在束缚应激期内粪便呈软便或糊状便，粪便颗粒数及湿重大于对照组(P<0.05)，粪便含水量亦明显多于对照组(P<0.05，表1)。表1 DIBS与对照组排便情况的比较（略）

　　2.2 各组血清PYY水平及Kd值和Bmax值

　　①UC组与DIBS组血清PYY水平明显高于正常对照组(P<0.05)，且UC组明显高于DIBS组(P<0.05)；②UC组大鼠空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的Kd值及Bmax值，与对照组和DIBS组比较均无明显差异(P>0.05，表2)。表2 各组大鼠Kd值及Bmax值的比较（略）

　　3 讨 论
　　
　　溃疡性结肠炎是一种以腹泻、黏液脓血便、腹痛为主要临床表现的肠道疾病，其病变主要局限于黏膜与黏膜下层，病变轻重不等，多呈反复发作性的慢性病程[1]。目前，该病的病因及发病机制仍未明确，而神经免疫因素是溃疡性结肠炎的研究中比较活跃的部分。近年来，很多学者也就胃肠激素与溃疡性结肠炎的关系作了多方面的研究。
　　
　　胃肠激素是由存在于胃肠道黏膜内的数十种内分泌细胞分泌的，主要化学成分为多肽，它可作为循环激素起作用，也可作为旁分泌物在局部起作用或者分泌入肠腔发挥作用。大量研究表明，UC的发病与胃肠激素水平的异常密不可分。KOCH等[13]发现UC患者结肠黏膜及黏膜下生长抑素(SS)含量较对照组明显降低，且随着黏膜炎症程度的加重，SS含量降低越明显；SURRENTI等[14]测定UC患者结肠、直肠黏膜中血管活性肠肽(VIP)的含量明显减少，而且VIP的减少也与黏膜的炎症程度有关；EVANGELISTA等[15]在三硝基苯磺酸诱导的溃疡性结肠炎大鼠中发现结肠组织降钙素基因相关肽(CGRP)的含量也是降低的，同时大量研究表明UC患者结肠黏膜P物质(SP)含量明显高于正常人[16]。综上所述可见，众多胃肠激素都与溃疡性结肠炎的发病密切相关。
　　
　　PYY作为近年发现的一种新的胃肠激素，其对胃肠道有多种复杂的生理功能。这使得它与许多胃肠疾病之间存在着不可分割的联系。PYY主要由分布于回肠及结肠黏膜的内分泌细胞即L细胞分泌，为36个氨基酸组成的肽类物质[17]。大量研究表明PYY与多种胃肠道疾病有关。ADRIAN等[18]测量了结肠癌组织，结肠息肉及正常结肠黏膜的PYY浓度，发现PYY浓度在管状息肉中最高，绒毛状息肉中其次，癌组织中最低，而这个顺序与细胞分化良恶程度是一致的。这说明PYY可能参与了结肠腺瘤样息肉转变为结肠癌的过程；有研究[19]在21例溃疡性结肠炎患者中测量PYY激素水平，发现其血清PYY水平明显升高。本实验通过测定UC模型大鼠血清内PYY的含量，结果表明，UC组血清内PYY水平较正常组明显升高，而阳性对照DIBS组血清内的PYY水平亦明显高于正常对照组。这说明PYY水平的异常可能与腹泻症状的产生有关。但是，从本实验中我们还可看出UC组血清PYY水平还明显高于DIBS组，从而推测UC时PYY水平的升高还可能与炎症病变有关。此方面还有待于进一步的研究。PYY作为胃肠道的一种抑制性激素，不仅抑制胃肠蠕动，而且可以抑制胃酸和肠液的分泌。PYY水平的升高可能是机体对抗腹泻和炎症的一种保护性作用。但是，由于许多胃肠激素的释放都有神经的协同作用，而且胃肠激素本身对胃肠道的调节作用也极其复杂，因此是否由于UC时其他胃肠激素水平的变化间接导致PYY水平的变化，还是由于UC这个始动因素直接导致PYY水平的变化还未明了，需要进一步的研究。
　　
　　胃肠激素对靶器官的作用不仅取决于激素水平的高低，而且还与受体的特性有关。代表受体亲和力的量化指标是平衡解离常数Kd值。Kd值与受体亲和力呈反向关系。受体的另一重要特征是受体的分布密度，其量化指标是最大结合容量Bmax值。Bmax值与受体的分布密度呈正向关系。早在1986年，MARC等[20]便通过放免实验证明PYY与大鼠空肠黏膜上皮细胞膜受体有较高的结合力，同时对大鼠的多个胃肠脏器包括胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠以及肝脏等进行PYY与其受体的特异结合实验，结果发现125IPYY在空肠与其受体的特异结合率最高。因此，本实验选择空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体作为研究对象，通过测定各组大鼠PYY受体的Kd值和Bmax值，来观察UC时PYY受体的变化。从本实验的研究结果可以发现UC组其Kd值和Bmax值与正常组比较均无统计学差异，从而推测UC时其肠道症状和炎性病变的发生与PYY受体的变化无关。

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