1,25(OH)2D3及复方丹参对大鼠异基因骨髓移植后造血重建及T细胞亚群的影响

　　　　 作者：严媚，温丙昭，曹琰，江明

【摘要】 目的 观察1，25(OH)2D3及丹参对异基因骨髓移植(AlloBMT)后造血重建和T细胞亚群的影响。方法 受鼠随机分成4组：A组(急性移植物抗宿主病，即aGVHD组)，B组(1，25(OH)2D3组)，C组(丹参组)，D组(两药联合组)。观察大鼠生存期、外周血象、aGVHD的临床表现及T细胞亚群。结果 各药物干预组与aGVHD组相比，其aGVHD的发病时间延迟、aGVHD评分降低、平均生存时间明显延长，差异均有统计学意义(P<0.05);各药物干预组外周血象恢复较快，在各不同时间点的变化均高于aGVHD组，差异亦有统计学意义(P<0.05);经干预方案处理后，CD4+、CD8+的数值明显较aGVHD降低，以CD4+细胞下降明显，而aGVHD时二者均明显增加，CD4+/CD8+的比值增大，结论 1，25(OH)2D3及复方丹参在异基因骨髓移植后对减轻aGVHD、促进造血重建及发挥免疫耐受有积极的作用。

【关键词】 T淋巴细胞亚群;异基因骨髓移植; 造血重建;1，25(OH)2D3;复方丹参

　　ABSTRACT: Objective To observe the influences of 1，25(OH)2D3 and salvia miltiorrhiza on hematopoiesis reconstruction and T cell subsets after allogeneic bone marrow transplantation in rats. Methods Donor rats were pided randomly into four groups， namely， Group A: aGVHD group; Group B: 1，25(OH)2D3 group; Group C: salvia miltiorrhiza group; and Group D: twodrug combination group. We observed the survival time， peripheral blood cells， clinical manifestations of aGVHD and the changes of rat T cell subsets. Results Compared with those in aGVHD group， in every drug intervention group， the time for illness attack of aGVHD was delayed， aGVHD scoring was reduced and the average survival time was obviously prolonged (P<0.05). In each pharmaceutical intervention group， the recovery of peripheral blood cells was rather quick， the change at every different time point was all higher than that in aGVHD group， and the differences were significant (P<0.05). After being treated with the intervention program， the numerical value of CD4+ and CD8+ was obviously reduced compared to that of aGVHD， and the cell number of CD4+ was conspicuously reduced; when aGVHD occurred， both were obviously increased and the ratio of CD4+/CD8+ was increased. Conclusion 1， 25(OH)2D3 and salvia miltiorrhiza play a positive role in reducing aGVHD， promoting hematopoiesis reconstruction and exerting immune tolerance after allogeneic bone marrow transplantation in rats.

　　KEY WORDS: T lymphocyte subset; allogeneic bone marrow transplantation; hematopoiesis reconstruction; 1，25(OH)2D3; salvia miltiorrhiza

　造血干细胞移植于上世纪60年代末逐渐开始应用于临床，随着研究的逐步深入及相应技术的发展，目前已成为国内外一致公认的治疗各种恶性血液病、遗传性血液病、重型再障、自身免疫性疾病及实体瘤等的有效方法。但由于存在HLA屏障，影响了正常造血干细胞的植入及受者的免疫重建，使异基因造血干细胞移植治疗的有效率还远不理想，其中移植后的移植物抗宿主病是导致移植失败并影响移植后长期生存的主要原因。要解决这一问题，首先要有基础研究提供相应的理论支持及手段，来阻止或减轻上述问题的发生，为临床治疗提供依据。本研究在建立了大鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病 (aGVHD)模型的基础上，移植前应用1，25(OH)2D3及复方丹参作为干预方案，观察其对大鼠异基因骨髓移植(AlloBMT)后造血重建及T细胞亚群的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 清洁级近交系雌性Wistar大鼠为受鼠，远交群清洁级雄性SD大鼠为供鼠，均为6～8周龄，体重180～210g，均由新疆医科大学动物中心提供。

　　1.1.2 主要试剂及仪器 RPMI1640(Gibco cat 30050043)溶液;T细胞亚群检测试剂均购自美国Beckman Coulter公司。直线加速器为瓦里安公司2300CD机型，能量6MV的X射线;Coulter Epics XL型流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验设计 采用RCT(随机对照)研究设计，将受鼠平均分入对照组即A组(aGVHD组)，干预组即B组(aGVHD+1，25(OH)2D3组)、C组(aGVHD+复方丹参组)、D组(aGVHD+1，25(OH)2D3+复方丹参组联合组，以下简称联合组)，每组10只。所有受鼠的分组情况对实验结果检测者采取盲法。

　　1.2.2 受鼠的术前准备及饲养条件 受鼠饲养于SPF级实验室，每周均以有效氯消毒鼠笼1次，所用饲料亦经60Co照射消毒。于移植前5d开始饮用含红霉素(250mg/L)和庆大霉素(32000u/L)、pH值在3.0～3.5之间的酸化水进行肠道清洁，并持续至实验结束。

　　1.2.3 供鼠骨髓细胞及脾细胞的制备 移植当天用20g/L的戊巴比妥纳麻醉供鼠，无菌切取股骨、胫骨、腓骨及脾脏，用RPMI 1640液反复冲洗髓腔及脾脏，通过200目金属网形成单细胞悬液，离心后去上清，trisNH4Cl溶液溶解红细胞，用不含血清的RPMI 1640培养液洗涤2次，行细胞计数并调成所需细胞浓度备用(4×107/mL)，台盼兰染色活细胞数>95%。

　　1.2.4 受鼠的移植过程 40只受鼠于移植当天置于无菌包装的有孔塑料盒内，接受8.5Gy的直线加速器的TBI，剂量率为1.0Gy/min，皮源距为120cm。细胞输注均于照射后4～6h进行，输注途径采用尾静脉注射。A组：骨髓细胞与脾细胞1∶1.5联合输注，输注供鼠的骨髓细胞2×108个/kg+脾细胞3×108个/kg，即建立aGVHD模型。B、C、D除建立aGVHD模型外，B组第6天起用骨化三醇微乳化制剂5000ng/(kg·d)灌胃，至术后15d为止;C组术前第6天起腹腔注射复方丹参注射液[20mg/(kg·d)丹参素]至术后15d为止;D组术前6d起给予骨化三醇和复方丹参。

　　1.2.5 观察指标 ①观察各组大鼠的生存期，生存超过50d的为长期生存;②观察各移植组大鼠aGVHD的发病时间、临床表现，予以临床aGVHD评分;③观察各组大鼠的造血恢复情况;④在不同时间点(第0、7、14、21天)测定各组大鼠的T细胞亚群。

　　1.2.6 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差(±s)描述数据的集中趋势、离散趋势;两组计量数据比较时先进行正态性及方差齐性检验，多组计量数据比较时先进行正态性及多个方差齐性检验，满足条件采用方差分析，如有差别再行LSD两两比较。检验水准α=0.05(双侧)。

　　2 结 果

　　2.1 各组受鼠的生存情况 A组大鼠于50d观察期内全部死亡，平均生存时间为(18.7±3.37)d;B、C、D组大鼠亦均于50d观察期内全部死亡，平均生存时间分别为(24.3±5.64)d、(24.5±4.38)d、(24.7±5.25)d，与A组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，而B、C、 D组之间相比差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.2 临床aGVHD的发病时间及评分 见表1。

　　2.3 各组大鼠移植后的造血重建 B、C、D组大鼠外周血白细胞、血红蛋白在不同时间点(第7、14、21天)的变化均高于A组，各组在第14天与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05);在移植后第21天白细胞、血红蛋白值均达到正常。血小板计数在各时间点均明显高A组，差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。

　　2.4 T细胞亚群的组间比较 各干预组与A组比较，第0天T淋巴细胞亚群差异无统计学意义;而第7、14、21天差异均有统计学意义(表3)。表1 大鼠临床aGVHD的发病时间及评分表3 T细胞亚群的组间比较

　　2.5 各组T细胞亚群在不同时间点的变化

　　2.5.1 A组CD4+、CD8+各时间点之间的比较 A组CD4+、CD8+在移植后第7天、14天其数值变化均较移植前(第0天)增高，呈上升趋势，以第14天增高最为明显，第21天降低;各时间点其数值变化与第0天比差异有统计学意义(CD4+ F=68.27，P=0.00;CD8+ F=17.81，P=0.00);A组CD4+/CD8+的数值变化以第14天增高最为明显，此数值变化与A组发生aGVHD的时间相一致(图1A)。

　　2.5.2 干预组CD4+、CD8+各时间点之间的比较

　　各干预组CD4+、CD8+在移植后第7天、14天其数值变化较移植前有所增高，第21天上升较为明显，与第0天相比差异有统计学意义(B、C、D组CD4+ F=27.94、68.71、4.26;P=0.00、0.00、0.03;CD8+ F=4.53、5.94、7.99、P=0.04、0.03、0.01、);各干预组CD4+/CD8+的走势同CD4+(图1B～1D)。

　　3 讨 论

　　随着对造血干细胞研究的不断深入，其应用领域也越来越广泛，但移植后是否能长期存活，关键是在于降低GVHD。尽管临床上也有许多手段来预防及治疗GVHD，包括应用细胞毒药物、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素和单克隆抗体等，取得了很大的疗效，降低了GVHD发生的严重程度，但是与此同时也带来许多毒副作用。为阻止或减轻该问题的发生，本研究从动物实验入手，为临床应用1，25(OH)2D3及复方丹参对异基因骨髓移植后降低aGVHD的发生及促进造血重建提供依据。

　　目前国内外的研究已证实，1，25(OH)2D3具有重要的免疫调节作用，可以调节细胞因子的产生、抑制移植物急性排斥反应、延长移植物生存期，对免疫系统也有广泛的作用[12]。1988年JORDAN等首先将1，25(OH) 2D3用于动物的器官移植实验。在小鼠的皮肤移植和大鼠同种心脏移植实验中，应用1，25(OH)2D3延长了移植物的存活时间;随后在大鼠原位肝移植[3] 、角膜移植[4]也均得出了相同的结果。中药在干细胞移植中的研究和临床应用虽然才刚开始，但其发挥的作用逐渐被人们所重视，特别是中药所具有的免疫调节及生物反应调节剂的功能，具有不可比拟的优势。复方丹参注射液是活血化淤药物，研究已证实其具有抑制血小板凝聚、降低血液黏度、抑制血栓形成及调节蛋白代谢和免疫功能的作用，在心脏及肾移植术后对急慢性排斥反应有抑制作用[56]。

　　本研究在建立异基因大鼠骨髓移植后aGVHD模型的基础上，将1，25(OH)2D3及复方丹参作为干预因素，研究其对大鼠异基因骨髓移植后造血重建及T细胞亚群的影响。结果显示，各药物干预组与aGVHD组相比，其aGVHD的发病时间延迟、临床aGVHD评分降低、平均生存时间明显延长;各药物干预组在骨髓移植后外周血白细胞、血红蛋白、血小板的恢复较快，在各不同时间点(第7，14，21天)的变化均高于aGVHD组，尤以第14天最为明显。说明1，25(OH)2D3及复方丹参在异基因骨髓移植后对减轻aGVHD、促进造血重建有积极的作用。

　　淋巴细胞亚群的变化是反映免疫系统变化的客观指标之一。CD4+及CD8+ 是参于器官移植的主要细胞。T细胞亚群及其比值的变化是个动态的过程，既可以出现高于正常的现象，也可以低于正常。因此，应用T细胞亚群及其比值的变化在一定程度上可以反映机体的免疫机能状况。本实验经干预方案处理后，CD4+、CD8+的数值明显较aGVHD组降低，以CD4+细胞下降明显;而发生aGVHD时二者均明显增加，CD4+/CD8+的比值增大。表明，CD4+、CD8+在排斥反应中起着重要作用，干预方案能够降低CD4+的数量。这可能正是其发挥预防和抗排斥作用的主要机制。CD4+、CD8 +及CD4+/CD8+与使用免疫抑制剂有相似变化[79]。

参考文献

　[1]杨守礼. 维生素D研究的新趋势维生素D免疫学 [J]. 中国骨质疏松杂志， 2004， l0(1):16.

　　[2]ZHANG AB， ZHENG SS， JIA CK， et a1. Effect of 1， 25dihydroxyvitamin D3 on preventing allograft from acute rejection fllowing rat orthotopic liver transplantation [J]. World J Gestroenterol， 2003， 9:10671071.

　　[3]章爱斌，郑树森，贾长库. 骨化三醇预防大鼠原位肝移植后急性排斥的动态观察 [J]. 中华普外科杂志， 2003， 18(12);738740.

　　[4]党森涛，陆晓和，周瑾，等. 1， 25二羟维生素D对高危角膜移植急性排斥反应及角膜新生血管的影响 [J]. 第一军医大学学报， 2004， 24(8):892896.

　　[5]戚峰，王鹏志，朱理玮，等. 复方丹参对异种移植物的保护作用 [J]. 天津医药， 2003， 31(12):780782.

　　[6]伍锟，张金彦，朱利军. 丹参在肾移植急性血管排斥反应治疗中的应用 [J]. 医学临床研究， 2003， 20(8):578580.

　　[7]WALSH PT， TAYLOR DK， TURKA LA. Tregs and transplantation tolerance [J]. J Clin Invest， 2004， 114(10):13981403.

　　[8]ASAIUIA H， KU CKATAOKA M， et al. Regulatory cells develop after the spontaneous acceptance of rat liver allograts [J]. Surgery， 2004， 136(3):532536.

　　[9]吕凌，张峰，浦立勇， 等. 自发免疫耐受大鼠移植肝内调节性T细胞的生物学特性 [J]. 中华器官移植杂志， 2007， 28(2):6770