不同连接比例叶酸偶联壳聚糖的制备

　　　　　　作者：赵颖，杨琰，卢实，张红菱

【摘要】 目的 叶酸与壳聚糖偶联，并制备不同连接比例的叶酸偶联壳聚糖。方法 通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应，制得叶酸偶联壳聚糖;采用红外光谱法验证偶联是否成功，紫外分光光度法测定每个壳聚糖上连接叶酸的量。结果 叶酸偶联壳聚糖红外光谱图表明，叶酸与壳聚糖成功偶联，并制备了每个壳聚糖上连接叶酸的量大致为3个、10个、20个、30个的叶酸偶联壳聚糖。结论 叶酸与壳聚糖成功偶联，并成功制备了不同连接比例的叶酸偶联壳聚糖。

【关键词】 叶酸;壳聚糖;偶联;基因治疗

　　ABSTRACT: Objective To couple folate with chitosan and prepare folatecoupled chitosan by different connection ratio. Methods The folatecoupled chitosan was prepared by the reaction of the activated folate ester with the amine group on the chitosan. Then the folatecoupled chitosan was verified by infrared spectroscopy. The number of folates in each of the chitosans was measured by UV spectrophotometry. Results Infrared spectroscopy showed that the folatecoupled chitosan was prepared successfully， and the number of folates in each chitosan was approximately 3， 10， 20 and 30. Conclusion Coupling of folate with chitosan was successful， and folatecoupled chitosan by different connection ratio was successfully prepared.

　　KEY WORDS: folate; chitosan; coupling; gene therapy

　　基因治疗是一种将外源基因导入目的细胞并有效表达从而达到治病目的的治疗方法。基因治疗载体一般分为病毒型载体和非病毒型载体。非病毒型基因载体壳聚糖(chitosan， CS)纳米粒，虽然具有无毒性、生物可降解性、良好的生物相容性以及其本身带正电荷易与DNA、RNA结合等优点，但其基因转染活性较低[12]。

　　叶酸叶酸受体靶向是近年来倍受青睐的一种新型抗肿瘤机制。通过配体受体作用可将基因、药物靶向导入高表达叶酸受体的病理组织和细胞中，而正常细胞不受影响，从而大大增加了基因治疗的安全性和有效性。因此，我们选择叶酸(folic acid， FA)修饰壳聚糖，并在后期研究中将其应用于基因转染技术中，以提高基因转染的靶向性和转染活性。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要仪器及试剂 AL204电子天平(梅特勒托利多仪器有限公司);DF101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂);UV240IPC紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司);NEXUS 670傅立叶红外光谱仪(美国尼高力仪器公司);冷冻干燥机(EZ550Q，美国)。壳聚糖(济南海得贝海洋生物工程有限公司，MW：50ku，脱乙酰度>90%);叶酸(上海伯奥生物科技有限公司);无水二甲基亚砜(DMSO，上海捷瑞生物工程有限公司);1(3二甲氨基丙基)3乙基碳化二亚胺[EDC，吉尔生化(上海)有限公司];其余试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 壳聚糖的纯化 壳聚糖用10mL/L醋酸溶解，滴加氨水使其沉淀，沉淀用去离子水洗涤至中性，冷冻干燥得到纯化的壳聚糖[3]。

　　1.2.2 壳聚糖脱乙酰度的测定 准确称取0.25g干燥至恒重的壳聚糖，置于250mL三角瓶中，加入20mL标准0.1mol/L盐酸溶液，室温磁力搅拌1h至全溶，加入10mL蒸馏水稀释，滴加3滴10g/L IKI指示剂。在磁力搅拌下，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至亮紫色颗粒状沉淀出现(充分振荡不溶解) 即为滴定终点[45]。重复测定3次取平均值，按以下公式计算脱乙酰度：

　　Nh3 %=(C1V1-C2V2)×0.016G×100

　　式中C1：盐酸标准溶液的浓度(mol/L);C2：氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L);V1：加入的盐酸标准溶液的体积(mL);V2：滴定消耗的氢氧化钠标准溶液体积(mL);G：样品质量(g);0.016：与1mL、1mol/L盐酸溶液相当的氨基量(g)。

　　脱乙酰度(D.D.)/%=Nh3 %9.94%×100

　　1.2.3 叶酸偶联壳聚糖(FACS)的制备和纯化 ①叶酸活性酯的制备：称取叶酸，用10mL DMSO溶解，再加入5倍量的EDC，25℃避光搅拌1h，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液[67]。②叶酸偶联壳聚糖的制备：称取壳聚糖溶解于5mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.7)中，磁力搅拌条件下缓慢加入叶酸活性酯的DMSO溶液，30℃下避光反应16h，然后用NaOH调pH至9.0。③叶酸偶联壳聚糖的纯化：混合液首先在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析3d，再在双蒸水溶液中透析3d，修饰后多聚物用冷冻干燥法分离收集备用[8]。

　　1.2.4 叶酸与壳聚糖偶联的验证 取叶酸、壳聚糖和叶酸偶联壳聚糖冻干粉，分别与溴化钾在玛瑙钵中一起研磨，压片，在傅立叶红外光谱仪中进行红外光谱测试。

　　1.2.5 不同连接比例叶酸偶联壳聚糖的制备 ①叶酸标准曲线的制备:精密称取叶酸10.3mg，置100mL容量瓶中，用醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.8)溶解并稀释至刻度，分别取0.5、1、1.5、2、2.5、3mL于10mL容量瓶中，用醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至刻度，以醋酸醋酸钠缓冲液为空白，用紫外分光光度计在363nm处测定吸光度。以叶酸浓度对吸光度做标准曲线。②偶联比的计算：精密称取少许叶酸偶联壳聚糖的冻干粉，溶解于20mL/L醋酸中，用20mL/L醋酸定容至10mL，然后在363nm处测定紫外吸光度，计算每毫克叶酸偶联壳聚糖中叶酸的量。③不同连接比例叶酸偶联壳聚糖的制备：当叶酸活性酯与壳聚糖分子上游离氨基的比例为1∶1时，测得每个壳聚糖上连接叶酸的最大量。在相同的实验条件下，改变叶酸、壳聚糖、EDC的用量，制备不同连接比例的叶酸偶联壳聚糖。

　2 结 果

　　2.1 壳聚糖脱乙酰度的测定 在壳聚糖脱乙酰度的测定方法中，以酸碱滴定法最简便快速、成本低廉、准确度较高，但在指示剂的使用中发现，用甲基橙和甲基橙苯胺蓝混合指示剂时终点变化不明显，误差较大。因此选择IKI指示剂，测定壳聚糖脱乙酰度为91.79%。

　　2.2 叶酸与壳聚糖偶联的验证 图1～3显示，在叶酸偶联壳聚糖的红外光谱图中，3444cm-1左右的峰是OH的伸缩振动吸收峰与NH的伸缩振动吸收峰重叠而成的多重吸收峰。图3中1563cm-1左右出现了一个新的吸收峰，表明壳聚糖的游离氨基与叶酸的羧基形成了酰胺键。

　　2.3 叶酸标准曲线的制备 叶酸在5.15～30.9μg/mL范围内与吸光度(A)呈良好的线性关系。回归方程为A=0.0127C+0.0116，r=0.9983。

　　2.4 不同连接比例叶酸偶联壳聚糖的制备 当叶酸活性酯与壳聚糖分子上游离氨基的比例为1∶1时，每个壳聚糖上连接叶酸的最大量大致为46个。根据文献报道，在叶酸蛋白质偶联物上平均一个蛋白质分子上偶联3个叶酸分子已有较强的靶向性[9]。因此，改变叶酸、壳聚糖、EDC的用量，制备了每个壳聚糖上连接叶酸的量大致为3、10、20、30个的叶酸偶联壳聚糖(表1、表2)。表2 叶酸偶联壳聚糖偶联比的测定

　　3 讨 论

　　与其他受体介导的基因投递方式相比，叶酸受体系统有其独特的优点：①不需合成和纯化配体蛋白，如转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白，无其他配体所致的潜在免疫原性;②结构相对简单，有明确的化学交联特性，容易合成;③体积较小，药代动力学特征更好，可重复给药;④仅在肿瘤细胞高表达，在正常组织无或很少表达，故具有很好的肿瘤组织特异性;⑤在人类一系列肿瘤中均有叶酸受体的高表达，靶向应用的范围很广[10]。因此，这种利用叶酸为靶弹头，结合药物/DNA，通过与叶酸受体特异结合而将药物靶向投递到肿瘤组织的靶向投递系统正倍受关注[11]。

　　本实验利用壳聚糖氮原子上的酰化反应，通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应制得叶酸偶联壳聚糖。叶酸是一个弱酰化剂，可加入缩合剂以提高反应活性。缩合剂首先与叶酸生成活性中间体，进一步与胺作用则得酰胺[12]。常用的此类缩合剂有二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和EDC等。考虑到EDC是水溶性缩合剂，其副产物是水溶性的，在后期的纯化过程中易于除去;而且，反应是在酸性环境下进行，在此条件下，碳二亚胺的活性不会受到影响。因此，选用EDC作为该反应的缩合剂。

　　本实验制备了不同连接比例的叶酸偶联壳聚糖。在后期研究中，将用复凝聚法制备叶酸偶联壳聚糖(FACS)DNA纳米粒，以Hela细胞为靶细胞，选择绿色荧光蛋白质粒基因(EGFP)作为报告基因，考察叶酸偶联壳聚糖转基因载体的靶向性和转染活性。

参考文献

　[1]赵惠萍，马瑜，边云飞，等. 载基因壳聚糖纳米粒的制备及其特性的研究 [J]. 中国药物与临床， 2008， 8(10):774776.

　　[2]LIU F， HUANG L. Development of nonviral vectors for systemic gene delivery [J]. J Control Release， 2002， 78:259266.

　　[3]郭建平，张涛. 壳聚糖纳米载体介导的端粒酶反义核苷酸对肝肿瘤细胞的抑制作用 [J]. 中国现代医学杂志， 2008， 18(8):10661068.

　　[4]王红昌，孙晓飞. 不同分子量高脱乙酰度壳聚糖的制备及表征 [J]. 中国海洋药物杂志， 2007， 26(1):1619.

　　[5]吴京平. 壳聚糖脱乙酰度酸碱滴定测定法的初步改进 [J]. 北京联合大学学报：自然科学版， 2003， 17(3):5256.

　　[6]刘海. 抗癌药靶向(叶酸介导)纳米给药系统的研究 [D]. 江西：南昌大学医学院， 2007.

　　[7]龙娜，项光亚，唐大宗，等. 叶酸介导的靶向性钆造影剂的制备及弛豫性能研究 [J]. 无机化学学报， 2007， 23(5):759764.

　　[8]张慧珠，高福平，杨心督，等. 壳聚糖脱氧胆酸及其叶酸偶联体的表征及自组装特性研究 [J]. 功能材料， 2008， 3(39):465472.

　　[9]LU YJ. Folatemediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents [J]. Adv Drug Deliv Rev， 2002， 54:675693.

　　[10]蒋建伟. 叶酸受体介导的药物靶向投递系统研究进展 [J]. 国外医学·临床生物化学与检验学分册， 2004， 25(4):345351.

　　[11]LEAMON CP， LOW PS. Folatemediated targeting: from diagnostics to drug and gene delivery [J]. Drug Discovery Today， 2001， 6(1):4451.

　　[12]闻韧. 药物合成反应 [M]. 第2版. 北京：化学工业出版社， 2003:134135.