华蟾素联合吉西他滨对肝癌HepG2细胞的抑制作用及对骨桥蛋白表达的影响

　　　　 作者：焦敏，南克俊，张茜，孙海凤，卢创新

【摘要】 目的 探讨华蟾素、吉西他滨及华蟾素与吉西他滨联合对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡情况的影响，研究华蟾素作用HepG2细胞后骨桥蛋白(OPN)表达的变化。方法 采用MTT法及流式细胞技术检测HepG2细胞对华蟾素、吉西他滨及华蟾素+吉西他滨的药物敏感性差异;采用免疫细胞化学法检测HepG2细胞中OPN的表达。结果 华蟾素和吉西他滨单药或联合用药对HepG2细胞的增殖呈抑制作用且呈现时间与浓度的依赖性，并能诱导HepG2细胞凋亡，联合组凋亡诱导作用强于单药组(P<0.05);华蟾素能下调HepG2细胞中OPN的表达。结论 华蟾素与吉西他滨联合对肝癌HepG2细胞具有协同抑制作用，可能通过抑制OPN的表达发挥抗癌作用。

【关键词】 肝癌;华蟾素;吉西他滨;骨桥蛋白;凋亡

ABSTRACT:Objective To investigate the antiproliferative and apoptogenic activities of cinobufotalin， gemcitabine (GEM) and cinobufotalin+GEM on HepG2 cells， and detect the expression of osteopontin (OPN) after treatment with cinobufotalin. Methods MTT was used to detect the antiproliferative effect of cinobufacin， GEM and cinobufacin+GEM on HepG2 cells. Immunocytochemistry was used to examine cellular localization and OPN levels. Results Cinobufacin， GEM， cinobufacin+GEM produced time and dosedependent inhibition of HepG2 cells. Cinobufacin+GEM showed a higher apoptosis rate induction than cinobufacin or GEM alone (P<0.05). The expression level of OPN was reduced by cinobufacin. Conclusion Cinobufacin combined with GEM has a synergistic anticancer effect on HepG2 cells probably through inhibiting OPN expression.

　　KEY WORDS: hepatocellular carcinoma; cinobufacin; gemcitabine; osteopontin (OPN); apoptosis

　　目前，原发性肝癌是世界上发病率较高且较常见的恶性肿瘤之一。我国是肝癌发病大国，寻找低毒、有效、安全的药物仍是肝癌治疗的关键。中药治疗肿瘤在我国有悠久的历史，其中华蟾素在我国广泛应用于临床，对于晚期肿瘤患者的疗效肯定。但是，华蟾素与其他药物的联合疗效及抗肿瘤的机制尚未完全明确。近年来，有证据显示骨桥蛋白(osteopontin， OPN)参与肿瘤的发生、发展。本研究旨在探讨华蟾素对肝癌细胞的抑制作用，及其对OPN表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人肝癌HepG2细胞株由西安交通大学医学院中心实验室惠赠。RPMI1640培养液购自美国Hyclone公司;小牛血清购自中美合资兰州民海生物公司;鼠抗人OPN单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司;华蟾素购自安徽淮北金蟾药业总公司;吉西他滨购自江苏恒瑞药业;噻唑蓝(MTT)系美国Sigma产品。

　　1.2 细胞培养 将HepG2细胞接种于100mL玻璃培养瓶中，在含体积分数100mL/L新生小牛血清的RPMI1640培养基中贴壁生长，于37℃、50mL/L CO2饱和温度培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3d传代一次。取对数生长期细胞进行试验。

　　1.3 实验分组 共分4组。根据文献资料及预试验结果分组如下：华蟾素组(H组)，包括H1、h3、H3、H4和H5共5个浓度点，其在培养中的终浓度分别为0.1、0.5、2.5、12.5、25mg/L;吉西他滨组(G组)，包括G1、G2、G3、G4和G5共5个浓度点，其在培养中的终浓度分别为1.25、2.5、5.0、10、20mg/L;联合用药组(L组)，以相应的华蟾素浓度和吉西他滨浓度联合应用;空白对照组(O组)，不加药，以等量培养液代替。

　　1.4 MTT试验 将对数生长期的HepG2细胞以2×104个/mL浓度200μL接种于96孔培养板上，RPMI1640培养基孵育24h后，倾去培养液。将不同处理组的药物分别加入孔内，每一浓度加4孔，每孔加200μL，对照组加等量培养液。孵育24h后，倾去药液及培养液，每孔加入5g/L MTT 20μL培养4h，倾去药液及培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，平板振荡仪振荡100min，在2500型酶标仪上以490nm波长检测各孔吸光度(A值)，根据A值计算抑制率，抑制率(%)=(1-A/A0)×100%。A：各药物浓度组光吸收值(均值)，A0：未加药物组(对照组)光吸收值(均值)。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 将对数生长期的HepG2细胞调整浓度至2×105个/mL细胞悬液，以2mL/孔接种于6孔板，RPMI1640培养基孵育48h后，分别加入H3、G3、L组处理组药物，继续培养24h，收集各处理组HepG2细胞，用PBS洗涤细胞二次收集(1～5)×105个细胞，加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5μL AnnexinV/FITC混匀后，再加入PI 10μL，旋涡混匀，室温避光染色15min;加入300μL结合缓冲液，进行流式细胞仪的观察和检测。

　　1.6 免疫细胞化学检测加药前后OPN的表达 常规制作细胞爬片，培养48h后用40g/L多聚甲醛溶液固定。按免疫细胞化学SP法步骤进行，用PBS代替一抗作为阴性对照。OPN主要在胞浆表达，呈棕黄色，空白对照呈阴性。200倍镜下随机取5个视野，计算每个视野阳性细胞数，平均阳性细胞数占总计数细胞>10%者为阳性，平均阳性细胞数<10%者为阴性(包括没有或仅有弱的染色)，阳性反应者用德国LeicaQ550cw图像分析系统在统一光强，统一放大倍数(200×)下测量表达情况，以染色最淡的视野为起点，随机选取视野测定其灰度值作为阳性表达的量化指标，并进行统计学分析。

　　1.7 统计学处理 所有实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行独立样本t检验，结果以±s表示，当P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同药物对HepG2细胞生长的抑制作用 华蟾素、吉西他滨以及两者联合，三组分别对肝癌HepG2细胞作用24h后的细胞增殖抑制率进行比较。结果表明：各组同一时间点不同浓度对HepG2细胞增殖抑制率不同，随浓度升高，增殖抑制率逐渐升高，有统计学差异(P<0.05);华蟾素与吉西他滨联合组对细胞生长抑制率高于单药组(P<0.05，表1)。表1 三组药物作用HepG2细胞24h后细胞增殖抑制率的比较

　　2.2 不同药物组对HepG2细胞凋亡的影响 采用AnnexinV/PI双染法，应用流式细胞仪检测各组药物分别作用HepG2细胞48h后其凋亡情况，发现两个单药处理组和药物联合组均高于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，药物联合组诱导凋亡能力高于两个单药处理组(P<0.05)(图1)。

　　2.3 华蟾素作用前后HepG2细胞中OPN表达的比较 正常OPN主要在胞浆表达，呈棕黄色均匀染色为阳性表达(图2)。对OPN表达阳性的样本行图像分析，测其灰度值作为其表达强度的量化指标。灰度值与实际表达强度成反比，即灰度值越低，阳性表达越强;灰度值越高，阳性表达越弱。OPN在华蟾素及药物联合组作用48h后表达均降低，与阴性对照相比均具有统计学差异(P<0.05);与华蟾素组相比，药物联合组OPN表达下降更明显，两者差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。表2 华蟾素作用48h后HepG2细胞中OPN的表达的灰度值

　　3 讨 论

　　华蟾素注射液在肿瘤临床治疗中已广泛应用。体外体内实验都显示出其良好的抗癌效果，可抑制白血病、肺癌、胃癌和肝癌等多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡[1，25]。从华蟾素的实验室研究及其在我国临床使用多年的经验来看，其单独使用的安全性已有保证，若能证实其配伍化疗药物治疗肿瘤的增效性和安全性， 将有较大意义，可为肝癌等易产生耐药现象的实体瘤的治疗提供有益的方法和实验依据。本研究证实华蟾素以时间和浓度依赖性的方式，通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，并与吉西他滨有协同治疗的作用，为肝癌治疗中使用华蟾素增敏化疗效果提供了实验依据。临床上华蟾素与化疗同步治疗肝癌，既可发挥化疗作用，又具有化疗增敏作用，使化疗的联合更加优化。这为肝癌治疗中的联合化疗用药提供了新的思路。

　　OPN是富含天冬氨酸和唾液酸残基的分泌型糖基化磷蛋白，包含有多种功能域。通过与整合素和CD44受体的结合，OPN可介导细胞与基质的相互作用及细胞内信号转导。近年来，越来越多的证据显示，OPN在许多肿瘤细胞中表达上调，并与肿瘤血管生成、侵袭转移、抑制凋亡等方面关系密切[7]。HIRAMA等[89]发现在转染OPN的鼠成神经母细胞细胞株C1300后，肿瘤生长增快、血管生成活跃。目前，研究认为OPN参与人体多种肿瘤的转化、侵袭和转移过程。它在一定程度上能够反映肿瘤的恶性程度[1014]。OPN可能是一个很好的监测肿瘤预后的指标及抗肿瘤治疗的靶点。本研究发现，华蟾素作用于肝癌HepG2细胞48h后，OPN的表达明显下降，可以推测，华蟾素抗肿瘤过程中可能是直接或间接地作用于OPN，进而影响相关信号转导通路的调节，导致肿瘤细胞的增殖延缓和凋亡发生。同时，与华蟾素单药组相比，药物联合组OPN表达下降更为明显。这可能是由于其与化疗药物联合使用后产生的化疗增敏作用所致，其具体的作用机制尚不清楚。明确华蟾素抗癌机制将有助于更合理科学地指导临床用药。

　　综上所述，本研究证明了中药华蟾素与吉西他滨联合对肝癌HepG2细胞具有协同抑制作用，可能通过抑制OPN的表达发挥抗癌作用。由于细胞凋亡是一个复杂的过程，中药华蟾素诱导HepG2细胞凋亡是否还与其他分子有关尚需进一步研究。

参考文献

　[1]韩克起，顾伟，苏永华. 蟾毒灵抗小鼠原位移植性肝痛整体药效学研究 [J]. 中华外科实验杂志， 2004， 21(12):14361439.

　　[2]NURIA P， FELIPE C. Bufalin influences the repair of Xrayinduced DNA breaks in Chinese hamster cells [J]. DNA Repair， 2003， 2(12):13531360.

　　[3]WEIDEMANN H. Na+/K+ATPase， endogenous digitalis like compounds and cancer developmenta hypothesis [J]. Front Biosci， 2005， 1(10):21652176.

　　[4]ENOMOTO A， RHO MC， KOMIYAMA K， et al. Inhibitory effects of bufadienolides on interleukin6 in MH60 cells [J]. J Nat prod， 2004， 67(12):20712072.

　　[5]刘鲁明. 华蟾素抗肿瘤作用的临床研究[J]. 世界科学技术中药现代化，2008， 10(4):126127.

　　[6]PRINCE CW， OOSAWA T， BUTLER WT， et al. Isolation， characterization， and biosynthesis of a phosphorylated glycoprotein from rat bone [J]. J Biol Chem， 1987， 262(6):29002905.

　　[7]孙长宇，张贤强，江河清，等. 肝细胞性肝癌组织中HBX蛋白与骨桥蛋白的表达 [J]. 郑州大学学报：医学版， 2009， 44(3):579582.

　　[8]YOU J， REILLY GC， ZHEN X， et al. Osteopontin gene regulation by oseiallatory fluid flow via intracellular caleiummobilizaion and activation of mitogenactivated protein kinase in MC3T3 El osteoblasts [J]. J Biol Chem， 2001， 276(16):133145.

　　[9]HIRAMA M， TAKAHASHI F， TAKAHASHI K， et al. Osteopontin overproduced by tumor cells acts as a potent angiogenic factor contributing to tumor growth [J]. Cancer Lett， 2003， 198 (1):107117.

　　[10]KOOPERMANN J， FEDARKO NS， JAIN A， et al. Evaluation of osteopontin as biomarker for pancreatic adenocarcinoma [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2004， 13(3):487 491.

　　[11]COPPOLA D， SZABO M， BOULWARE D， et al. Correlation of osteopontin protein expression and pathological stage across a wide variety of tumor histologics [J]. Clin Cancer Res， 2004， 10(1):184190.

　　[12]WEBER GF. The metastasis gene osteopontin:a candidate target for cancer therapy [J]. Biochimica te Biophysica Acta， 2001， 1552(5):6185.

　　[13]DENHARDT DT， MISTRETTA D， CHAMBERS AF， et al. Transcriptional regulation of osteopontin and the metastatic phenotype:evidence for an Ras activated enhancer in the human OPN promoter [J]. Clin Exp Metastasis， 2003， 20(1):7784.

　　[14]王斌，宋燕. 骨桥蛋白在结肠癌组织中的表达及血清水平检测 [J]. 吉林大学学报：医学版， 2007， 33(2):324326