Nephrin、TGFβ1和WT1在阿霉素肾病模型肾小球中的表达及意义

　　　　 作者：杨维娜，任淑婷，成少利，张耀杰，于琳华，郭尚温，李恒力

【摘要】 　　目的 探讨足细胞的数量及nephrin、转化生长因子β1(TGFβ1)蛋白在阿霉素肾病模型肾小球中的表达及意义。方法 建立阿霉素诱导的大鼠肾病模型，于不同实验时间点检测血、尿生化指标；光镜、电镜观察肾脏的组织病理学改变；免疫组化技术检测足细胞数量、nephrin、TGFβ1蛋白的表达情况。结果 该模型的肾脏病理学改变明显；1周末足细胞nephrin表达减弱(P<0.05)，8周末肾小球TGFβ1表达增强(P<0.05)、足细胞数量减少(P<0.05)；nephrin与24h尿蛋白定量(r=-0.83，P<0.01)、尿素氮(r=-0.68，P<0.05)、血肌酐(r=-0.71，P<0.05)呈负相关；TGFβ1与24h尿蛋白定量(r=0.45，P<0.05)、尿素氮(r=0.62，P<0.05)、血肌酐(r=0.59，P<0.05)呈正相关；足细胞数量与24h尿蛋白定量(r=-0.63，P<0.05)、尿素氮(r=-0.72，P<0.05)、血肌酐(r=-0.76，P<0.05)呈负相关；足细胞数量与nephrin呈正相关(r=0.78，P<0.01)，与TGFβ1呈负相关(r=-0.64，P<0.05)。 结论 经改良间隔2周两次尾静脉注射阿霉素(4mg/kg)可以成功复制阿霉素肾病急性和慢性模型；阿霉素肾病蛋白尿的发生和进展与nephrin表达异常密切相关；TGFβ1加重了足细胞数量减少启动的局灶节段性肾小球硬化。

【关键词】 阿霉素肾病；nephrin；转化生长因子β1；足细胞

　　ABSTRACT: Objective To investigate podocyte number， the expression of nephrin and transforming growth factorβ1(TGFβ1) in adriamycininducednephropathy rat model and its significance. Methods The rat adriamycin nephrosis model was constructed to detect blood and urine biochemical indicators and observe the pathological changes of renal tissues by light microscope and electron microscope. The expression levels of nephrin and TGFβ1 as well as the podocyte number were examined at different time points by immunohistochemistry. Results The pathological changes of the renal tissues were obvious. Nephrin presented a weak signal at the end of the first week (P<0.05). TGFβ1 started to increase (P<0.05) while the podocyte number started to decrease at the end of the eighth week (P<0.05). Expression of nephrin was negatively correlated with the 24h urinary protein (r=-0.83， P<0.01)， blood urea nitrogen (r=-0.68， P<0.05) and serum creatinine (r=-0.71， P<0.05). Expression of TGFβ1 was positively correlated with the 24h urinary protein (r=0.45， P<0.05)， blood urea nitrogen (r=0.62， P<0.05) and serum creatinine (r=0.59， P<0.05). The podocyte number was negatively correlated with the 24h urinary protein (r=-0.63， P<0.05)， blood urea nitrogen (r=-0.72， P<0.05) and serum creatinine (r=-0.76， P<0.05); it was positively correlated with nephrin (r=0.78， P<0.01) but negatively correlated with TGFβ1 (r=-0.64， P<0.05). Conclusion The acute and chronic adriamycin nephrosis models were successfully established by injecting adriamycin 4mg/kg into tail vein twice every two weeks. The genesis and development of proteinuria are closely related to the abnormal expression of nephrin. Focal segmental glomerulosclerosis occurs when the podocyte number decreases and TGFβ1 accelerates it.

　　KEY WORDS: adriamycin nephropathy; nephrin; transforming growth factorβ1; podocyte

　　目前，足细胞损伤与肾小球疾病关系的研究已成为探索肾小球疾病发病学的热点[1]。研究表明，足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin表达异常与蛋白尿的发生密切相关[2]。转化生长因子β1(transforming growth factorβ1， TGFβ1)被认为是致肾纤维化的重要细胞因子之一。文献报道，肾小球蛋白高滤过可以诱导足细胞分泌TGFβ1[3]，提示足细胞可能通过TGFβ1对肾小球疾病的进展起重要的调节作用。我们前期的研究发现，足细胞数量减少启动了局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis， FSGS)的发生。但足细胞的数量减少到多少可以启动FSGS的发生?Nephrin、TGFβ1在肾小球疾病的发生发展过程中是如何变化的?这些问题目前尚不清楚。为此，本研究拟建立改良的阿霉素肾病模型，延长观察时间至12周，以便连续动态观察阿霉素肾病的病变特点、进展变化、足细胞数量及nephrin、TGFβ1的表达情况，旨在进一步探讨足细胞损伤引发蛋白尿的机制及其在FSGS发生发展中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及试剂

　　健康清洁级雄性SD大鼠60只，体重180～220g(西安交通大学医学院实验动物中心提供)；注射用盐酸阿霉素10支(浙江海正药业股份有限公司)；兔抗大鼠nephrin抗体、兔抗大鼠TGFβ1抗体、兔抗大鼠WT1抗体(Santa Craz生物工程有限公司)；即用型非生物素免疫组化ElivisionTM plus检测试剂盒(福州迈新生物工程公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型的制作及分组

　　实验前大鼠适应性标准饲养3d，其后随机分为阿霉素肾病模型组(40只)和正常对照组(20只)。模型组于实验开始后第1天、第14天分别从尾静脉注射阿霉素(adriamycin， ADR)4mg/kg(ADR按2g/L溶于生理盐水中)；对照组于相同时间分别从尾静脉注射等容积生理盐水。放入代谢笼内饲养，自由摄食、饮水。从第2次注射后连续观察至12周末。存活的大鼠于第2次注射ADR后的7、14d时检测尿蛋白，尿蛋白定量>100mg/24h提示模型复制成功。期间3只大鼠死亡，1只制备模型失败，被剔除。

　　1.2.2 大鼠的血、尿生化检测

　　各组均于第1次ADR注射前1d、第2次ADR注射后1周末、4周末、8周末及12周末用代谢笼收集24h尿液检测尿蛋白。模型组于收集尿液结束当天每次随机取大鼠10只、对照组相应每次随机取大鼠5只，乙醚吸入麻醉，心脏穿刺采血，检测血清总蛋白(total protein， TP)、白蛋白(albumin， ALB)、胆固醇(cholesterol， ChoL)、甘油三酯(triglyceride， TG)、血尿素氮(blood urea nitrogen， BUN)及血肌酐(serum creatinine， Scr)。

　　1.2.3 肾脏的病理形态学观察

　　收集尿液及心脏穿刺采血后处死大鼠，剖腹取肾，分为两部分，进行如下观察：①肾组织经甲醛溶液固定、乙醇脱水、石蜡包埋后，制成3μm厚的切片，作HE、PAS、Masson染色后光镜下观察；②肾组织取出后切成1mm3的小块，经戊二醛固定、四氧化俄后固定、乙醇梯度脱水、环氧树脂EPON812浸透、包埋，超薄切片后醋酸铀、柠檬酸铅染色，透射电镜下观察、拍照。

　　1.2.4 肾脏的免疫组织化学检测及半定量分析

　　采用免疫组织化学染色ElivisionTMplus法：石蜡切片梯度脱蜡，PBS冲洗后放入枸橼酸钠缓冲液中入微波炉修复抗原，正常小牛血清封闭，分别滴加一抗，兔抗大鼠nephrin、TGFβ1、WT1多克隆抗体，置湿盒中4℃冰箱过夜，次日PBS缓冲液浸洗后滴加Envision试剂，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。实验设有空白对照(PBS液代替一抗)。应用MOTIC病理图像分析系统对免疫组化结果进行半定量分析。每例标本随机选取10个视野输入计算机进行分析，自动得出免疫组化染色吸光度并计算出阳性积分吸光度。阳性积分吸光度值越大，蛋白表达越强。

　　1.2.5 足细胞数量的检测

　　WT1可作为足细胞胞核的特异性标记用来计数足细胞。足细胞计数采用disector/fractionator方法[4]。操作步骤：①做2μm厚连续切片(50张连续切片)，进行 WT1免疫组化染色；②从所获得的连续切片最前面的第1张到第10张片子中的随机位置开始挑出1对毗邻的连续切片(间隔2μm)，以后每隔10张切片选取1对切片，这样可以保证在贯穿同一肾小球上下的条件下获得3～4对切片；③采用MOTIC病理图像分析系统，在电脑屏幕上将每1对切片并排放在一起，进行计数；④计算足细胞数，公式如下：n=f/t×Q-/2=f1/t×(n1+n2+n3+n4)/2；⑤每张切片上随机选取5个肾小球进行记数，取其均数作为该实验的足细胞数/肾小球，计算对照组及各阿霉素组足细胞数/肾小球。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS 13.0统计分析软件对所得数据进行统计学处理。所有数值以均数±标准差表示，两组间的比较经方差齐性检验后，采用t或t′检验；多组间的比较经单因素方差分析后，采用LSD检验行各组间均数的两两比较；相关性采用Spearman相关分析的方法。P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠的血、尿生化检测定量分析

　　模型组第2次注射ADR 1周末、4周末、8周末、12周末24h尿蛋白定量，与同期正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，且随时间的延长24h尿蛋白定量逐渐增高，12周末达高峰。模型组TP、ALB 4周末开始下降(P<0.05)，8周末明显下降，12周末达最低值；TG、ChoL 4周末开始升高(P<0.05)，8周末达高峰，12周末略有下降；BUN、Scr 8周末开始升高(P<0.05)，12周末明显升高，表明已有肾功能损伤。

　　2.2 肾脏的病理形态学变化

　　光镜下模型组4周末可见足细胞肿胀(图1A)；8周末可见球囊粘连，部分肾小球肥大、毛细血管腔变窄，管内蛋白管型较前增多(图1B)；12周末可见肾小球肥大明显，肾小囊扩张，囊壁增厚，球囊粘连明显，部分肾小球节段性轻、中度硬化，间质内有明显灶性淋巴细胞浸润，并有轻度纤维化(图1C)。透射电镜显示，模型组4周末足突融合变扁平，足细胞微绒毛样改变，肾小球基底膜(glomerular basement membrane， GBM)厚薄不均；8周末足突融合、消失，系膜区中度增宽，GBM部分增厚；12周末足突广泛融合、消失，肾小球毛细血管丛与囊壁粘连，GBM增厚和塌陷，间质内有淋巴细胞浸润，纤维母细胞增生和胶原纤维形成。同一肾小球中病变不同，有的足突广泛融合，有的足突存在，证明病变是局灶节段性的。

　　2.3 足细胞nephrin蛋白的表达情况
　　
　　Nephrin免疫组化染色阳性物质呈棕黄色颗粒。空白对照组无表达。正常对照组nephrin沿肾小球毛细血管袢足细胞侧呈均匀、线状分布，且表达较强(图2A)。模型组1周末，nephrin在肾小球的分布不均，染色强度减弱；4周末进一步减弱，部分区域线性消失，呈团块状(图2B)；12周末明显减弱(图2C)。半定量分析显示，nephrin在阿霉素肾病不同组别中的阳性积分吸光度依次递减。模型1周组、4周组、8周组、12周组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，模型组之间比较也有统计学差异(表1)。

　　2.4 肾小球TGFβ1蛋白的表达情况

　　TGFβ1免疫组化染色阳性物质呈棕黄色颗粒。空白对照组无表达；正常对照组TGFβ1主要在小管、间质细胞的胞质和细胞膜表达，小球毛细血管上皮细胞有少量表达(图3A)；模型组8周末肾小球内TGFβ1表达增强(图3B)，12周末明显增强。半定量分析显示，TGFβ1在阿霉素肾病不同组别中的阳性积分吸光度依次递增。模型8周组、12周组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，模型组之间比较也有统计学差异(表1)。

　　2.5 不同组别中的足细胞数量

　　WT1免疫组化染色阳性物质呈棕黄色颗粒仅在足细胞核表达。空白对照组无表达；正常对照组肾小球内WT1阳性细胞数多，且染色较强(图4A)；模型组8周末足细胞数量减少，12周末明显减少(图4B)。足细胞数量在阿霉素肾病不同组别中依次递减。模型8周组、12周组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，模型组之间比较也有统计学差异(表1)。

　　2.6 Nephrin、TGFβ1表达及足细胞数量与24h尿蛋白定量和肾功能的相关性分析

　　Nephrin表达与24h尿蛋白定量(r=-0.83，P<0.01)、BUN(r=-0.68，P<0.05)、Scr(r=-0.71，P<0.05)呈显著性负相关；TGFβ1表达与24h尿蛋白定量(r=0.45，P<0.05)、BUN(r=0.62，P<0.05)、Scr(r=0.59，P<0.05)呈显著性正相关；足细胞数量与24h尿蛋白定量(r=-0.63，P<0.05)、BUN(r=-0.72，P<0.05)、Scr(r=-0.76，P<0.05)呈显著性负相关。表1 肾小球内nephrin、TGFβ1蛋白表达及足细胞数量的图像分析结果（略）

　　3 讨 论
　　
　　近几年关于蛋白尿的研究多以足细胞或裂孔隔膜相关蛋白为重点。nephrin是裂孔隔膜(slit diaphragm， SD)的主要结构蛋白，在控制肾小球滤过屏障通透性方面起关键性作用[5]。研究表明，在NPHS1突变的芬兰型先天性肾病综合征中，无nephrin表达，电镜下SD也完全消失[6]。nephrin敲除的小鼠，其SD扭曲变形，生后不久死于严重的蛋白尿。对人类胎肾发育的研究表明，在肾小球发生过程中如无nephrin则最终SD不能形成[7]。在大鼠嘌呤霉素肾病、被动Heymanns肾炎和由链脲霉素引发的糖尿病中有nephrin表达的下降[8]。在人类获得性蛋白尿性肾脏疾病中，nephrin的变化各家报告常不一致。本实验通过间隔2周两次尾静脉注射4mg/kg ADR，成功建立了动态阿霉素肾病模型，第1周到第4周为急性阿霉素肾病模型，病理改变与人的微小病变性肾病(minimal change disease， MCD)相似；第5周到第12周为慢性阿霉素肾病模型，病理改变与人的FSGS相似。并发现模型组1周末nephrin在肾小球中的分布不均、染色强度减弱，第4周进一步减弱，部分区域线性消失，呈团块状分布。这可能是由于阿霉素及其代谢产物从DNA水平直接干预了nephrin蛋白的合成，使足突裂孔隔膜结构发生紊乱，造成足突融合，最终发生大量蛋白尿。至实验结束肾小球内nephrin持续低水平表达仍未见恢复，提示阿霉素对nephrin合成代谢的损伤持续存在，这可能是阿霉素肾病模型蛋白尿持续存在的原因。本实验在急性模型期还发现，nephrin的表达在出现明显蛋白尿及足突融合之前已经显著下降，故nephrin是判断肾小球足细胞急性损伤的一个早期重要指标。随着nephrin表达的减少，24h尿蛋白定量呈增加趋势，二者之间呈显著性的负相关性。可能是由于nephrin分布方式的改变，打乱了其与足细胞细胞骨架之间的正常连接，继而导致了足突形态的改变以及蛋白尿的发生。故nephrin分布方式改变可能是大量蛋白尿发生的始动因素，而不是蛋白尿所致的继发性改变。

　　目前研究发现，在一些伴有大量蛋白尿的肾小球疾病中可观察到足细胞数量的减少[9]。足细胞数量减少的原因包括：凋亡、脱落、增殖有限、表型转变[10]。ASANUMA等[11]研究认为，bFGF、TGFβ1、PDGF等生长因子可以导致局部蛋白酶及其抑制剂的分泌不平衡，蛋白水解活性增加诱导GBM退化，造成足细胞和基底膜连接的损害，启动足细胞从GBM脱落。我们前期的研究显示，表面黏附分子α3β1整合素在足细胞表达减少与足细胞的脱落及FSGS的发生相关[12]。本实验在此研究基础上，对足细胞的减少作了科学的定量观察，发现FSGS发生时足细胞数量减少了约16%。足细胞数量究竟减少到超过哪一临界水平时可启动肾小球硬化，目前尚未见有文献报道，仍需进一步研究。

　　TGFβ是一种多功能的细胞因子，有TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3三种异构体，在肾脏TGFβ1表达最多，主要在肾小管上皮细胞高表达，在肾小球表达量相对少些[13]。有文献报道，以细胞外基质(extracellular matrix， ECM)积聚为特征的成人IgA肾病、FSGS、新月体肾炎、狼疮肾炎和糖尿病患者肾小球、肾间质TGFβ1 mRNA水平明显升高[1415]。本实验发现，模型组8周末肾小球内TGFβ1表达增强，12周末明显增强。不同组别间TGFβ1与24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐呈显著性正相关。这可能是由于肾小球蛋白高滤过诱导足细胞分泌TGFβ1增多，剌激肾小球ECM合成和通过多种途径抑制ECM降解；同时TGFβ1又作用于足细胞，使其分泌GBM成分增多，加速肾脏纤维化和硬化的进程。故TGFβ1协同足细胞数量减少启动了FSGS的发生。

　　本实验动态观察了阿霉素肾病大鼠模型不同时间点肾小球nephrin、TGFβ1及足细胞数量的变化，为研究以足细胞损伤为早期病变的肾小球疾病提供了实验数据和基础理论，也为临床以保护足细胞的功能和数量为主的肾小球疾病的治疗提供了新思路。

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