测定奥美拉唑的流动注射化学发光新方法

【摘要】 目的 建立测定奥美拉唑的流动注射化学发光新方法。方法 当将奥美拉唑注入到高锰酸钾与鲁米诺反应的合并流中时，可检测到强的化学发光信号，结合流动注射技术对实验条件进行优化。结果 在优化的实验条件下，即混合管长度：150cm，反应介质的碱度：0.15mol/L NaOH，鲁米诺的浓度：7.0×10-5mol/L，高锰酸钾的浓度：2.0×10-5mol/L以及试剂流速：2.8mL/min，奥美拉唑浓度在2.0×10-8～1.0×10-5g/mL范围内与相对化学发光强度具有线性关系;对浓度为1.0×10-7g/mL和1.0×10-6g/mL奥美拉唑溶液进行11次平行测定的相对标准偏差分别为1.0%和2.6%;该方法的检出限为3×10-9g/mL。结论 该方法简单、快速、灵敏，适用于药物制剂中奥美拉唑的含量测定。

【关键词】 奥美拉唑;化学发光;流动注射;药物

　　ABSTRACT: Objective To develop a new flowinjection chemiluminescence (FICL) method for the determination of omeprazole. Methods Strong chemiluminescence (CL) signal was found generated when omeprazole was injected into the reaction mixture of KMnO4 and luminol. The experimental conditions that affected the CL reaction were optimized by using FI mode. Results Under the optimum experimental conditions (150cm of mixing tubing， 0.15mol/L NaOH， 7.0×10-5mol/L luminol， 2.0×10-5mol/L KMnO4 and 2.8mL/min of flow rate)， CL intensity was linearly related to the concentration within the range of 2.0×10-8-1.0×10-5g/mL. The detection limit was 3×10-9g/mL omeprazole， and the relative standard deviations (n=11) were 1.0% and 2.6% for 1.0×10-7g/mL and 1.0×10-6g/mL omeprazole solutions， respectively. Conclusion The proposed method is simple， rapid， sensitive， and suitable for determining omeprazole content in pharmaceutical preparations.

　　KEY WORDS: omeprazole; chemiluminescence; flowinjection; pharmaceutical

　　奥美拉唑(omeprazole)，化学名称为5甲氧基2[[[4甲氧基3，5二甲基2吡啶基]甲基]亚硫酰基]1H苯并咪唑，是一种新型胃酸分泌抑制剂，为高效安全的抗消化道溃疡药物。奥美拉唑能特异性地作用于胃黏膜壁细胞， 降低胃黏膜壁细胞中H+K+ATP酶的活性从而抑制胃酸的分泌，已被广泛应用于十二指肠溃疡、胃溃疡和反流性食管炎的治疗。

　　目前，奥美拉唑的分析方法有分光光度法[13]、伏安法[45]、极谱法[67]、液相色谱法[810]、毛细管电泳法[11]和液相色谱质谱法[1213]等。化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优点，已被广泛用于药物的分析测定[1417]。利用化学发光法测定奥美拉唑的文献报道仅有1篇，即张淑琼[18]利用奥美拉唑对硫酸铈连二亚硫酸钠化学发光反应体系的增强作用，建立了测定奥美拉唑的化学发光法。该方法测定奥美拉唑的线性范围为3.0×10-7～3.0×10-5g/mL，检出限为3×10-7g/mL。

　　本研究根据将奥美拉唑注入到高锰酸钾与鲁米诺化学发光反应的反应混合液中时，可以产生强的化学发光信号这一发现，结合流动注射技术，优化了实验条件，建立了利用这一化学发光反应测定奥美拉唑的流动注射化学发光新方法。该方法已被用于奥美拉唑肠溶胶囊中奥美拉唑的含量测定，结果与药典方法的测定值相一致[19]。

　　1 实验材料与方法

　　1.1 仪器 IFFMD型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈电子科技有限公司)，流路如图1所示。聚四氟乙烯管(PTFE，0.8mm i.d.)用于连接系统中的所有组件。蠕动泵用来输送所有溶液，每一管道的流速为2.8mL/min。样品注射(50mL)借助于六通阀自动完成。化学发光信号用CR105型光电倍增管(北京滨松电子科技有限公司)检测，数据获得和处理通过IFFMD化学发光数据处理系统(西安瑞迈电子科技有限公司)完成。CRT970荧光分光光度计(上海分析仪器厂)用来绘制荧光光谱和化学发光光谱。

　　图1 流动注射化学发光流路示意图

　　Fig.1 Schematic diagram of CL flow system

　　a：奥美拉唑溶液;b：鲁米诺溶液;c：高锰酸钾溶液;L：混合管;P：蠕动泵;V：注射阀;F：流通池;PMT：光电倍增管;HV：高压;PC：计算机;W：废液。

　　1.2 试剂和溶液 奥美拉唑标准溶液(5.00×10-4g/mL)的配制：准确称取50.0mg奥美拉唑标准品(中国药品生物制品检定所提供)，用少量水溶解后，转移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至标线，摇匀。储于4℃冰箱中，使用时用水逐级稀释至所需浓度。

　　鲁米诺储备液(1.0×10-2mol/L)的配制：准确称取1.77g鲁米诺(陕西师范大学合成)，用1mol/L的氢氧化钠溶液50mL溶解后，用二次水定容至1L容量瓶中，室温下放置1周后使用。

　　高锰酸钾储备液(2.0×10-2mol/L)的配制：称取3.16g高锰酸钾(西安化学试剂厂)，溶解于1L沸水中，玻璃纤维过滤，室温下放置2周后使用。

　　除鲁米诺外，其它所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

　　1.3 实验方法 准确移取一定量的奥美拉唑标准溶液或样品溶液于50mL容量瓶中，加水至标线，摇匀，作为试液。按照图1所示流路，管道(a，b和c)分别连接奥美拉唑溶液、鲁米诺溶液和高锰酸钾溶液。鲁米诺溶液首先通过Y型混合器与高锰酸钾溶液在线混合反应。待基线稳定后，50mL奥美拉唑溶液借助于六通阀自动注入到鲁米诺溶液与高锰酸钾溶液的合并流中，产生化学发光信号。以相对化学发光强度对奥美拉唑进行定量。

　　2 结果与讨论

　　2.1 实验条件的选择 以2.0×10-7g/mL奥美拉唑溶液对实验条件进行优化，优化的实验参数包括混合管长度、反应介质的碱度、鲁米诺和高锰酸钾的浓度，以及试剂流速。

　　高锰酸钾可在碱性溶液中氧化鲁米诺产生化学发光。为了降低背景信号，获得最大的灵敏度，在高锰酸钾溶液与鲁米诺溶液的汇合点与进样阀之间连接一混合管(0.8mm i.d.)，使高锰酸钾溶液与鲁米诺溶液充分混合并反应。考察混合管的长度在20～250cm范围内对化学发光反应的影响。结果表明，随着混合管长度的增长，背景信号逐渐降低，但化学发光信号无明显变化;当混合管长度为150cm时，信噪比有最大值，因此选择混合管长度为150cm。

　　高锰酸钾与鲁米诺之间的化学发光反应须在碱性条件下进行。在反应中，反应介质的碱度通过改变鲁米诺溶液中氢氧化钠的浓度加以调节。考察了氢氧化钠浓度在0.01～0.20mol/L范围内对化学发光反应的影响。如图2所示，相对化学发光强度随着氢氧化钠浓度的增大而增大;当氢氧化钠浓度为0.15mol/L时，相对化学发光强度值达到最大;当氢氧化钠浓度高于0.15mol/L时，相对化学发光强度逐渐降低。因此，选择0.15mol/L的氢氧化钠。

　　观察鲁米诺浓度在1.0×10-5～1.0×10-4mol/L范围内对化学发光反应的影响，结果见图3。当鲁米诺浓度在1.0×10-5～7.0×10-5mol/L范围内，相对化学发光强度随着鲁米诺浓度的增大而增大;当鲁米诺浓度高于7.0×10-5mol/L时，相对化学发光强度随着鲁米诺浓度的增大而降低。因此，选择鲁米诺的浓度为7.0×10-5mol/L。

　　图3 鲁米诺浓度对相对化学发光强度的影响

　　Fig.3 Effect of luminol concentration on the relative CL intensity

　　实验条件：2.0×10-7g/mL奥美拉唑，0.15mol/L NaOH，2.0×10-5mol/L KMnO4，混合管长度150cm，试剂流速2.8mL/min。

　　对高锰酸钾浓度在5.0×10-6～6.0×10-5mol/L范围内对化学发光反应的影响进行考察。结果显示(图4)，当高锰酸钾浓度为2.0×10-5mol/L时，反应有最大的相对化学发光强度;高于或低于2.0×10-5mol/L高锰酸钾均导致相对化学发光强度的降低。因此，选择高锰酸钾的浓度为2.0×10-5mol/L。

　　图4 高锰酸钾浓度对相对化学发光强度的影响

　　Fig.4 Effect of luminol concentration on the relative CL intensity

　　实验条件：2.0×10-7g/mL奥美拉唑，0.15mol/L NaOH，7.0×10-5mol/L鲁米诺，混合管长度150cm，试剂流速2.8mL/min。

　　试剂流速影响化学发光反应的发光强度。对试剂流速在2.1～3.5mL/min范围内对化学发光反应的影响进行了考察(图5)。结果表明，当试剂流速低于2.8mL/min时，相对化学发光强度随着试剂流速的增大而增大;当试剂流速高于2.8mL/min时，相对化学发光强度随着试剂流速的增大而减小。本文选择的流速为2.8mL/min。

　　2.2 分析特性 在选定的实验条件下，奥美拉唑浓度在2.0×10-8～1.0×10-5g/mL范围内与相对化学发光强度具有线性关系。为了提高测定的准确度，校准曲线按数量级分段绘制，校准曲线的基本参数见表1。对相关系数进行t检验，结果表明，在99%置信水平上，该校准曲线具有很好的线性关系。

　　图5 试剂流速对相对化学发光强度的影响

　　Fig.5 Effect of flow rate on the relative CL intensity

　　实验条件：2.0×10-7g/mL奥美拉唑;0.15mol/L NaOH;7.0×10-5mol/L鲁米诺;2.0×10-5mol/L KMnO4，混合管长度150cm。表1 校准曲线的线性范围及回归方程

　　对浓度为1.0×10-7g/mL和1.0×10-6g/mL奥美拉唑溶液进行11次平行测定的相对标准偏差分别为1.0%和2.6%;按照IUPAC建议，计算出方法的检出限为3×10-9g/mL。

　　2.3 干扰研究 在选定的实验条件下，对浓度为5.0×10-7g/mL奥美拉唑溶液进行了干扰试验。结果表明，在保持相对测量误差在±5%范围内，1000倍的NO3-、SO42-、Cl-、C2O42-、脲;100倍的Ca2+、Zn2+、CO32-、PO43-、淀粉;50倍的乳糖、葡萄糖;2倍的Mg2+以及同倍的Al3+、Pb2+对测定无干扰。

　　2.4 样品分析 取市售不同厂家的奥美拉唑肠溶胶囊各10粒(标示量：25mg/粒)，准确称量后，研细，混匀，从中称取适量粉末，加水溶解后，转入50mL容量瓶中，加水定容，摇匀，作为样品溶液。准确移取适量样品溶液经适当稀释后，按照实验方法进行化学发光强度测定，计算胶囊中奥美拉唑的含量，并与药典方法[19]进行对照，结果见表2。t检验表明，两种方法的测定结果在95%置信水平上无显著性差异。表2 奥美拉唑肠溶胶囊中奥美拉唑含量测定

　　2.5 可能的化学发光反应机理 为了探讨可能的化学发光反应机理，我们进行了如下的实验：

　　在改装的CRT970荧光分光光度计上分别绘制了高锰酸钾鲁米诺反应和高锰酸钾鲁米诺奥美拉唑反应的化学发光光谱。结果表明，两个反应的化学发光光谱具有相同的最大发射波长，均位于425nm处。这一最大发射波长与文献报道的鲁米诺的氧化产物——3氨基邻苯二甲酸根离子(3AP)[20]的最大发射波长相一致。这表明高锰酸钾鲁米诺奥美拉唑化学发光反应的发光体仍为激发态的3氨基邻苯二甲酸根离子[21]。

　　将碱性鲁米诺溶液加入高锰酸钾溶液中，高锰酸钾溶液的紫红色很快变淡，最后，溶液呈淡绿色(锰酸根离子的颜色)。这说明，在高锰酸钾与鲁米诺的反应中，高锰酸钾被还原为锰酸钾[22]，鲁米诺被氧化为3氨基邻苯二甲酸根离子[20]。

　　在CRT970荧光分光光度计上分别绘制了奥美拉唑溶液、高锰酸钾奥美拉唑碱性反应液、鲁米诺高锰酸钾碱性反应液、鲁米诺高锰酸钾奥美拉唑碱性反应液的荧光光谱。奥美拉唑溶液的激发波长和发射波长分别位于310～380nm(λex=341nm)和380～550nm(λem=471nm)。当向奥美拉唑溶液中加入高锰酸钾溶液后，其激发光谱和发射光谱的形状和最大激发波长的位置没有改变，但荧光强度显著降低。鲁米诺高锰酸钾碱性反应液和鲁米诺高锰酸钾奥美拉唑碱性反应液具有相同的激发光谱和荧光光谱，激发波长和发射波长分别位于240～400nm(λex=314nm)和370～550nm(λem=425nm)，这与文献报道的3氨基邻苯二甲酸根离子激发和发射光谱相一致[20]。另外，可以看出，奥美拉唑溶液的激发波长范围与鲁米诺高锰酸钾碱性反应液和鲁米诺高锰酸钾奥美拉唑碱性反应液的激发波长范围有很大重叠。因此我们推断，高锰酸钾与奥美拉唑反应释放的能量有可能被3氨基邻苯二甲酸根离子吸收形成激发态的3氨基邻苯二甲酸根离子。

　　基于以上讨论，我们建议鲁米诺高锰酸钾奥美拉唑化学发光反应的机理可能为：高锰酸钾与奥美拉唑反应，释放出能量，该能量被3氨基邻苯二甲酸根离子吸收而产生激发态的3氨基邻苯二甲酸根离子，当它回到基态时，产生化学发光。该化学发光反应机理可表示为：

　　鲁米诺+高锰酸钾→3氨基邻苯二甲酸根离子+锰酸钾+hν(425nm)

　　高锰酸钾+奥美拉唑→奥美拉唑的氧化产物+锰酸钾+能量

　　3氨基邻苯二甲酸根离子+能量→激发态的3氨基邻苯二甲酸根离子

　　激发态的3氨基邻苯二甲酸根离子→3氨基邻苯二甲酸根离子+hν(425nm)

　　3 结 论

　　本研究发现奥美拉唑在鲁米诺高锰酸钾体系中的后化学发光反应。在对化学发光光谱、荧光光谱及有关实验的基础上，提出了可能的化学发光反应机理，优化了实验条件，建立了测定奥美拉唑的高灵敏流动注射化学发光分析法。建立的方法被成功用于药物制剂中奥美拉唑的含量测定。

参考文献

　[1]WAHBI AAM， ABDELRAZAK O， GAZY AA， et al. Spectrophotometric determination of omeprazole， lansoprazole and pantoprazole in pharmaceutical formulations [J]. J Pharm Biomed Anal， 2002， 30(4):11331142.

　　[2]KARLJIKOVICRAJIC K， NOVOVIC D， MARINKOVIC V， et al. Firstorder UVderivative spectrophotometry in the analysis of omeprazole and pantoprazole sodium salt and corresponding impurities [J]. J Pharm Biomed Anal， 2003， 32(45):10191027.

　　[3]SALAMA F， ELABASAWY N， RAZEQ SAA， et al. Validation of the spectrophotometric determination of omeprazole and pantoprazole sodium via their metal chelates [J]. J Pharm Biomed Anal， 2003， 33(3):411421.

　　[4]RADI A. Anodic voltammetric assay of lansoprazole and omeprazole on a carbon paste electrode [J]. J Pharm Biomed Anal， 2003， 31(5):10071012.

　　[5]金根娣，胡效亚，冷宗周，等. 奥美拉唑在碳糊电极上的吸附伏安测定法研究 [J]. 分析测试学报， 2003， 22(4):7376.

　　[6]OEZALIN N， TEMIZER A. Differential pulse polarographic determination of omeprazole in pharmaceutical preparations [J]. Electroanalysis， 1994， 6(9):799803.

　　[7]曹尔新，曾泳淮. 奥美拉唑的示波极谱法测定及其电化学行为 [J]. 分析科学学报， 2001， 17(2):110113.

　　[8]JIA H J， LI W， ZHAO K. Determination of omeprazole in rat plasma by highperformance liquid chromatography without solvent extraction [J]. J Chromatogr B， 2006， 837(12):112115.

　　[9]SCHUBERT A， WERLE A L， SCHMIDT C A， et al. Determination of omeprazole in bulk and injectable preparations by liquid chromatography [J]. J AOAC Int， 2003， 86(3):501504.

　　[10]SLUGGETT GW， STONG JD， ADAMS JH， et al. Omeprazole determination using HPLC with coulometric detection [J]. J Pharm Biomed Anal， 2001， 25(34):357361.

　　[11]PEREZRUIZ T， MARTINEZLOZANO C， SANZ A， et al. Determination of omeprazole， hydroxyomeprazole and omeprazole sulfone using automated solid phase extraction and micellar electrokinetic capillary chromatography [J]. J Pharm Biomed Anal， 2006， 42(1):100106.

　　[12]HOFMANN U， SCHWAB M， TREIBER G， et al. Sensitive quantification of omeprazole and its metabolites in human plasma by liquid chromatographymass spectrometry [J]. J Chromatogr B， 2006， 831(12):8590.

　　[13]WANG J， WANG Y W， FAWCETT J P， et al. Determination of omeprazole in human plasma by liquid chromatographyelectrospray quadrupole linear ion trap mass spectrometry [J]. J Pharm Biomed Anal， 2005， 39(34):631635.

　　[14]LIANG Y D， SONG J F， TIAN T. Determination of pipemidic acid based on flowinjection chemiluminescence due to energy transfer from peroxynitrous acid synthesized online [J]. Anal Bioanal Chem， 2004， 380(78):918923.

　　[15]LIU H Y， ZHANG L， HAO Y H， et al. Flowinjection chemiluminescence determination of meloxicam by oxidation with Nbromo succinimide [J]. Anal Chim Acta， 2005， 541(12):185190.

　　[16]XI J， JI X H， ZHANG S H， et al. Investigation of RuBPSCe(IV) chemiluminescence reaction and its application in determination of two diuretics [J]. Anal Chim Acta， 2005， 541(12):191196.

　　[17]DU J， LU J. Flow injection chemiluminescence determination of isoniazid using the lucigeninperiodate system [J]. Luminescence， 2006， 21(1):2630.

　　[18]张淑琼. 化学发光法测定雷贝啦唑、奥美啦唑 [J]. 西南师范大学学报(自然科学版)， 2006， 31(6):8789.

　　[19]中国人民共和国药典委员会. 中国人民共和国药典(二部) [M]. 北京:化学工业出版社， 2005:783.

　　[20]WHITE E H， BURSEY M M. Chemiluminescence of luminol and related hydrazides:the light emission step [J]. J Am Chem Soc， 1964， 86(5):941942.

　　[21]WHITE E H， ZAFIRIOU O， KAGI H H， et al. Chemilunimescence of luminol:the chemical reaction [J]. J Am Chem Soc， 1964， 86(5):940941.

　　[22]杜建修，刘文侠，吕九如. 高锰酸钾鲁米诺反应体系中碱土金属离子化学发光行为的研究 [J]. 化学学报， 2004， 62(14):13231326.