作者：王宏芳，李雪静，浦昀，李金华，徐坤，宋秀玲，李娟
【摘要】 目的 探讨松茸多糖(PTM)对辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用。方法 90只健康雄性ICR小鼠随机分为正常对照组(NC)、照射对照组(IC)和PTM组，每组30只。PTM组小鼠给予1200mg/kg剂量PTM灌胃，每天1次，连续7d;第8天给予IC组和PTM组动物全身一次性照射，总剂量2.0Gy。检测小鼠照射后第1、5、14天的脾指数、脾细胞对ConA诱导的增殖反应、巨噬细胞吞噬功能和抗体生成能力。结果 与IC组比较，PTM组小鼠的脾指数、脾细胞对ConA的增殖反应、巨噬细胞吞噬功能和抗体生成能力均明显增强(P<0.01)，且照射后第14天PTM组小鼠脾指数、脾细胞对ConA的增殖反应能力、巨噬细胞吞噬率和抗体生成能力与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 松茸多糖对辐射所致的小鼠免疫功能损伤有明显的保护作用。
【关键词】 松茸多糖;X射线;免疫功能;脾指数;巨噬细胞
松茸(tricholoma matsutake)是一种纯天然的食用菌类，被誉为“菌中之王”，主要分布在日本、朝鲜半岛以及我国东北和西南地区。松茸菌肉肥厚，有香气，味道鲜美，而且富含蛋白质、脂肪和多种氨基酸，具有很高的营养价值[1]。此外，松茸具有强身、益肠胃、止痛、理气化痰、驱虫等功效。现代科学研究表明，松茸具有抗癌、抗炎等特殊作用[23]。松茸多糖(polysaccharides of tricholoma matsutake， PTM)是从天然真菌植物松茸中分离得到的一种植物多糖。关于松茸提取物质的免疫增强作用、抗肿瘤活性及治疗支气管炎等功能已有文献报道[45]，而对于松茸多糖辐射防护作用的研究较少，主要源自本课题组的实验研究[67]。本研究通过观察松茸多糖对辐射损伤小鼠免疫功能的影响，探讨其辐射防护作用，为进一步研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 受试物 松茸多糖(PTM)是从盛产于吉林省长白山区天然真菌-松茸中提取的多糖类化合物。由本课题组采用索氏提取法提取，制备溶液时以生理盐水溶解。
1.2 实验动物、分组及处理 健康雄性ICR小鼠，体重(20±2)g，6～8周龄，由吉林大学基础医学院动物中心提供。小鼠按体重随机分为正常对照组(NC)、辐射照射组(IC)和PTM给药组(PTM)3组，每组30只。NC组和IC组给予生理盐水灌胃;PTM组给予剂量为1200mg/kg体重的PTM灌胃，每天1次，连续7d。第8天除NC组外，均接受X线照射。分别于照射后第1、5、14天，每组处死10只动物，进行相关指标的检测。
1.3 主要实验仪器 SWCJIF型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);G3022型酶标仪(中国南京);Olympus倒置显微镜(Olympus公司，日本);CO2恒温孵箱(SANYO公司，日本)。
1.4 检测指标
1.4.1 脾脏指数的测定 小鼠称重，脱臼处死取脾脏，电子天平称重计算脾指数。
脾指数=脾脏重量体重×100%
1.4.2 脾细胞对ConA反应性的测定 采用MTT法。小鼠脾细胞浓度调成1×107个/mL，ConA浓度为10μg/mL，加于96孔平底培养板，37℃、50mL/L CO2培养箱中培养48h，终止培养前4h每孔加入10μL MTT，培养结束后，吸出上清，每孔加入二甲亚枫100μL，570nm酶标仪测定A值。
1.4.3 巨噬细胞吞噬功能的测定 小鼠腹腔注射100g/L淀粉悬着液1mL，24h后腹腔注射20mL/L鸡红细胞1mL，30min断头处死，腹腔注射0.2mL肝素注射液，吸腹腔液于玻片上展开，湿盒中37℃温育30min，瑞士-姬姆萨染色5min，PBS冲洗，自然干燥，显微镜下观察，计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数。
吞噬百分率(%)=200个巨噬细胞中吞噬CRBC的巨噬细胞数200个巨噬细胞数×100%
吞噬指数=200个巨噬细胞吞噬CRBC总数200个巨噬细胞数×100%
1.4.4 B淋巴细胞功能的测定 采用玻片小室法。小鼠腹腔注射50mL/L SRBC悬液0.2mL，4d后脱臼处死，取出脾脏，用磷酸缓冲生理盐水制成单细胞悬液，调细胞浓度为1×107个/mL，冰浴中保存备用;取0.24mL脾细胞悬液、0.24mL 200mL/L SRBC悬液和0.92mL新鲜的豚鼠稀释血清混匀，取混合液0.1mL加入到玻片小室中，平行样2份，小室两端用石蜡封口后，置37℃温箱中孵育1h，取出后显微镜下计数小室中形成的空斑数。结果换算：结果用106个脾细胞形成的PFC数表示。
1.5 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行统计分析。实验数据用±s表示，实验组与对照组间数据比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 小鼠脾脏指数 小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天小鼠脾指数明显低于同期NC组(P<0.01);PTM组脾指数在照射后第1、5、14天明显高于同期IC组(P<0.01)，且第14 天 PTM组脾指数与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。表1 PTM对照射后不同时期小鼠脾指数的影响
2.2 脾细胞对ConA的反应性 小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天小鼠脾细胞对ConA刺激的增殖反应明显低于同期NC组(P<0.01)。预防给予PTM组小鼠脾细胞对ConA刺激的增殖反应高于同期IC组(P<0.01)，且第14天PTM组小鼠脾细胞对ConA刺激的增殖反应与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05，表2)。表2 PTM对照射后不同时期小鼠脾细胞增殖反应的影响
2.3 小鼠巨噬细胞的吞噬功能 小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天小鼠巨噬细胞的吞噬率及吞噬指数均低于同期NC组(P<0.01);预防给予PTM组小鼠巨噬细胞吞噬率及吞噬指数均高于同期IC组(P<0.01)，且第14 天PTM组小鼠巨噬细胞吞噬率与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05，表3、表4)。表3 PTM对照射后不同时期小鼠巨噬细胞吞噬率的影响
2.4 小鼠B淋巴细胞的抗体生成能力 小鼠受到2.0Gy射线照射后，第1、5、14天，各组小鼠抗体生成细胞数量明显低于同期NC组(P<0.01);预防给予PTM组小鼠抗体生成细胞数量明显高于同期IC组(P<0.01)，且第14天PTM组小鼠抗体生成数量与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05，表5)。表4 PTM对照射后不同时期小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响表5 PTM对辐射损伤小鼠脾细胞抗体生成能力的影响
3 讨 论
机体的免疫系统是辐射损伤的敏感系统，辐射作用于脾脏、胸腺等器官可使机体免疫功能降低。免疫系统是以网络调节形式发挥作用的，并与神经内分泌及凝血系统相互作用，因而免疫细胞、组织及器官的局部损害，必然会累及其他多个系统，导致生物体感染、出血，诱发多种放射病;且由于免疫功能下降，肿瘤免疫逃逸机率大为增加，使肿瘤的治疗更加困难。因此，提高机体免疫功能是辐射防护的重要手段。
本研究是在本课题组陈月月[6]初步探讨的基础上进行的后续研究，通过建立辐射损伤模型来观察PTM对辐射损伤小鼠免疫系统的辐射防护作用。结果显示，与正常对照组比较，受照小鼠脾脏萎缩、脾脏指数下降，脾细胞对ConA的反应性降低，腹腔巨噬细胞的吞噬功能下降，B细胞产生特异性抗体的能力下降。表明电离辐射可破坏小鼠机体的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫功能。主要原因为电离辐射可损伤参与免疫应答的细胞，使其数量减少，使残存细胞功能低下，尤其是淋巴细胞的数量和功能的下降幅度更为严重。照射前预防给予PTM，可以显著降低上述辐射损伤，表明PTM对小鼠的免疫系统具有一定的防护作用，并能促进免疫功能的恢复。PTM的辐射防护作用可能与多糖的生物活性有关。多糖是细胞膜的重要组分，可以强化免疫细胞，抵御射线对细胞膜的损伤。细胞上含有多糖受体，多糖成分作用于细胞膜，使膜上相关分子活化，启动信号传导途径，从而保证受损细胞的生命活动得到加强。同时，多糖具有一定的清除自由基活性，使辐射所致的继发性氧化损伤得到降低[8]。由此推断，松茸多糖对免疫系统的辐射防护作用可通过2个途径实现：①PTM可提高免疫细胞对电离辐射的抗性，促进电离辐射损伤的修复;②PTM能减少自由基的生成，降低自由基对机体造成的损伤。
参考文献
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