人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究

　　 作者：孙国栋，李志忠，王晶，林永新，洪亮，吴波文，焦根龙，邵建立

【摘要】 　　目的 探讨并优化人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定；诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化，为其进一步应用奠定基础。方法 用酶消化法分离培养hUCMSCs，通过传代培养、扩增，倒置光学显微镜及原子力显微镜下观察细胞形态；MTT法检测细胞增殖曲线，流式细胞仪检测免疫表型；体外向成骨、脂肪方向诱导分化，并通过特异性染色鉴定其分化能力。结果 采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs。接种24h，贴壁细胞形态多为长梭型、多边形或成纤维细胞样形态，大小均一。P3、P7代细胞的生长曲线基本一致，增殖能力强。流式细胞仪分析，第3代细胞强烈表达CD29、CD44、CD105，不表达CD34、CD45和HLADR。经成骨诱导分化后4周，碱性磷酸酶染色呈强阳性，茜素红染色可见明显钙结节；经成脂诱导3周，油红O染色呈阳性，有明显的脂滴出现。结论 本实验建立了一套体外稳定培养扩增hUCMSCs的方法。所培养的细胞成分单一、扩增迅速、生物学形状稳定，并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化，有望成为组织工程较为理想的种子细胞。

【关键词】 脐带；间充质干细胞；分化；成骨细胞；脂肪细胞

　　ABSTRACT: Objective To establish an optimized method to isolate， culture and identify human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs) in vitro and induce their osteogenic and adipogenic differentiation. Methods The hUCMSCs were isolated from human umbilical cord by digestion with collagenase. After serial subcultivation in vitro， the stem cells were passaged. Morphologic appearance of hUCMSCs was observed under an optical microscope and atomic force microscope. The proliferation rate was measured by MTT assay. Cell cycle and surface antigens were measured by flow cytometry. The osteogenic and adipogenic differentiation was tested and evaluated by specific staining methods. Results The isolation of hUCMSCs by digestion with collagenase was efficient. After seeded for 24 hours， the adherent cells showed spindle shape and fibroblast celllike shape and the size of hUCMSCs was homogeneous. The similar growth curves of passage 3 and 7 exhibited a great potential for proliferation. Flow cytometry analysis revealed that CD29， CD44 and CD105 were highly expressed on the surface of passages 3 cells， but the expression was negative for CD34， CD45 and HLADR. After culture in inducing medium， the cells were successfully induced into osteogenic and adipogenic lineages. These cells were highly positive for alkaline phosphate staining and also showed mineralization presented with von kossa staining after 4 weeks culture induction of osteogenic differentiation. Furthermore， liquid vacuoles were detected by oil red O staining after 3 weeks culture induction of adipogenic differentiation. Conclusion An in vitro method for isolation and purification of hUCMSCs from human umbilical cord has been established. The cultured cells were composed of only undifferentiated cells and their biological properties were stable. The hUCMSCs are expected to be a new type of stem cells of tissue engineering.

　　KEY WORDS: umbilical cord; mesenchymal stem cells (MSCs); differentiation; osteocyte; adipocyte

　　人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells， hUCMSCs)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源丰富，易于采集、保存和运输，无异体排斥，避免伦理争议等诸多优点。大量研究表明，hUCMSCs具有多向分化潜能，在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等[1]。因此，其在组织工程、造血干细胞移植以及基因治疗等领域具有广阔的应用前景，成为干细胞研究的热点。本研究探讨hUCMSCs的体外分离、 纯化、扩增以及定向分化条件，为hUCMSCs在组织工程中的进一步应用提供理论依据和技术支持。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Ⅱ型胶原酶(GIBCO，美国)；DMEM/F12培养基(HYCLONE，美国)；胎牛血清(HYCLONE，美国)；地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、β甘油磷酸钠和抗坏血酸(Sigma，美国)。恒温恒湿培养箱(SHELLAB，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；原子力显微镜(THERMO，美国)；流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)；恒温摇床(哈尔滨市东明医疗仪器厂)；超净工作台(苏州净化设备厂)；培养瓶、培养皿、离心管(Corning，美国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 hUCMSCs的分离与培养

　　从手术台取正常足月产健康婴儿脐带组织(根据医院规定并经家属同意)，浸泡于DMEM中。超净台内取出脐带，DHanks平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，并将其剪碎至1mm×1mm×1mm大小组织块。将组织块移至1g/L的胶原酶Ⅱ中，加入少许DMEM，在37℃恒温震荡仪内消化，直至Wharton胶全部消化。将含细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的DMEM反复吹打稀释，1500r/min离心10min，弃上清液，用含150mL/L FBS的DMEM/F12的培养基清洗，使细胞悬液均匀分布，转移至普通培养瓶中，在37℃、50mL/L CO2培养箱内培养。细胞贴壁后，第3天首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4d换液1次。倒置相差显微镜下观察。细胞达80%融合后，用1.25g/L的胰酶消化，按1∶2～1∶3的比例传代，续扩增培养。

　　1.2.2 细胞生长曲线的绘制

　　分别取P3、P7代对数期生长的hUCMSCs，胰酶消化，用含150mL/L胎牛血清的DMEM/F12悬浮，以4×104/mL的细胞密度接种于96孔培养板中，每孔200μL，每孔培养液的量均为1mL，从培养的次日起每天每组定时消化3孔行MTT法检测，酶标仪(BioRad，Model 550)读取490nm吸光度(A)值，绘制细胞生长曲线。

　　1.2.3 细胞表型的测定

　　用流式细胞仪对第3代MSCs表面特异性抗原进行检测。2.5g/L胰蛋白酶消化待检细胞，PBS洗涤3次，制成1×106/mL的细胞悬液。将待检细胞样品分为每管0.1mL，加入各类待测一抗，4℃孵育30min，加入荧光标记的二抗，4℃孵育30min，最后用100mL/L甲醛溶液固定细胞，用流式细胞仪测定各类抗原的阳性率。

　　1.2.4 体外多向诱导分化

　　以生长良好的第3代细胞为实验细胞。细胞经消化后调节密度为2×104个/mL，分别接种入12孔培养板和预置盖玻片的6孔培养板，24h后细胞完全贴壁，更换分化诱导培养基并分别设对照组。向成骨细胞诱导分化：以成骨诱导培养基培养(DMEM/F12培养基，100mL/L FBS、10-8mol/L地塞米松、10mmol/L β甘油磷酸钠和50mg/L抗坏血酸)，每3～4d全量换液1次，培养至第4周时行碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色。向脂肪细胞诱导分化：以成脂肪诱导培养基培养(DMEM/F12培养基，100mL/L FBS、地塞米松1μmol/L、胰岛素5u/mL、吲哚美辛0.5μmol/L)，每3～4d全量换液1次，培养至第21天时作油红“O”染色。

　　1.3 统计学方法

　　应用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析。采用两因素的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 细胞形态学及生长特点

　　倒置显微镜下观察，原代接种24h即可见有少量细胞贴壁，外观呈纺锤形和多角形，并可见细胞核。培养至7d可见细胞数量开始增多，细胞形态为长而扁平的梭形，为典型的成纤维细胞形态(图1A)。培养至10d左右细胞汇合达到90%左右，细胞呈极性排列，集落呈漩涡状(图1B)。这时按1∶2传代，细胞传代后，贴壁速度增快，生长迅速；48h后，贴壁的细胞间可见有细胞集落形成，细胞大多呈长梭形，细胞核较大，数量也逐渐增多；3d后首次换液，5～7d左右细胞便铺满瓶底，融合成片，细胞排列较整齐，分布较均匀，生长较一致，杂细胞相对已较少可再次传代。原子力显微镜下可见，培养早期的MSCs多呈长梭形，细胞质与细胞核边界清晰，细胞体积很大，细胞长度超过100μm，细胞向四周延伸出数量不等的伪足样突起。对其局部结构观察发现，细胞边缘有较多的伪足，两端有鱼尾状或树枝状骨架，其形态较复杂(图2)。

　　2.2 hUCMSCs的生长曲线

　　hUCMSCs生长曲线呈S形，接种后第0～1天为潜伏适应期，从第2天起细胞开始增殖并进入对数生长期，第5天达到高峰，以后进入平台期。根据生长曲线可知hUCMSCs的群体倍增时间为26h(图3)。增殖曲线显示，P3、P7组间差异无统计学意义(P>0.05)，说明本实验中P3、P7代细胞增殖速率无明显差异。

　　2.3 细胞免疫表型分析

　　经流式细胞仪检测，hUCMSCs均一地高表达间质细胞标志CD29、CD44、CD105，不表达造血系标志CD34、CD45和人白细胞抗原HLADR(图4)。CD29为整合素家族中最重要的成员，是介导细胞与细胞外基质粘附作用的主要因子，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种活动。CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，其正常功能是作为受体识别透明质酸(HA)和胶原蛋白Ⅰ、Ⅳ等，主要参与细胞细胞，细胞基质之间的特异性粘连过程。CD34和CD45是造血干细胞阳性标记，HLADR为MHCⅡ类分子，其阴性表达说明细胞具有弱免疫原性，有利于异基因移植。本实验结果表明，脐带来源的MSCs与骨髓、脐血等其他组织来源的MSCs流式检测表型一致。

　　2.4 体外诱导分化检测

　　2.4.1 hUCMSCs成骨诱导的形态变化及功能鉴定

　　成骨诱导5d左右，细胞形态逐渐由长梭形变为方形、鳞片形、三角形或多角形等。高倍镜下可见细胞质内含颗粒样物质。第8天时，细胞外基质分泌增多，胞质中及胞质外均可见较多细小黑色颗粒，胞核颜色较淡，胞质色变深。3周时细胞生长密集，中央可见类似结节状的结构，部分细胞呈现层叠样生长。4周时可见局部由棕黑色细胞外基质沉积。

　　碱性磷酸酶染色可见，经诱导后的大多数细胞胞质中有浅棕色至棕黑色细小颗粒或大片状黑色沉淀，显示强阳性，符合成骨细胞的特征(图5)。茜素红染色后镜下可见细胞密集处有红色的沉着物，呈团样并向四周放射，中心颜色明显加深 (图6)。说明hUCMSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜能。

　　2.4.2 hUCMSCs成脂诱导的形态变化及功能鉴定

　　成脂诱导5d左右，细胞形态逐渐由长梭形变为短梭形；在诱导约14d时细胞变为椭圆形、圆形；21d时胞质内可见脂滴形成，油红“O”染色呈强阳性(图7)。说明hUCMSCs在体外具有向脂肪细胞分化的潜能。

　　3 讨 论

　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)是一类具有显著的自我更新和多向分化能力的细胞，他来源丰富，主要有骨髓、脐血、脐带、全身结缔组织和器官间质[24]。目前骨髓是实验和临床研究中MSCs的主要来源，但存在自身局限性。骨髓每106个细胞中含有1～10个干细胞，并且成人骨髓源MSCs的细胞数量及增殖分化潜能随供者年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且供者MSC的采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制[2]。脐血MSCs来源充足但MSCs分离效率低，限制了其在组织工程和细胞治疗中的广泛应用[5]。因此，有必要寻求组织工程种子细胞新的来源。

　　近年来，国内外学者对hUCMSCs进行研究并取得了一定成果。有研究表明，脐带中富含干细胞，平均每厘米脐带组织中含有4×105个[6]，远远高于骨髓中的含量。脐带间充质干细胞有望取代骨髓间充质干细胞成为组织工程中更为理想的种子细胞。因为其除具有取材方便、来源广、数量充足、增殖能力强、长期传代表型及增值能力不改变、分泌具有合适构成的细胞外基质等特点外，还具有以下优点：①采集脐带对产妇和新生儿没有任何危害及损伤；②干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力；③免疫细胞较为幼稚，功能活性低，免疫功能不够成熟，处于一种缄默状态，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病；④不会有肿瘤细胞、病毒和病原微生物的感染及传播几率也相对较低；⑤不涉及社会、伦理及法律方面的更多争议。

　　目前分离hUCMSCs的方法主要有酶消化法和组织块培养法。因为组织块培养法的原代培养时间为12～15d，培养时间较长，而采用胶原酶消化法可快速获得大量贴壁生长的MSCs，且操作简便易行，可更好地保持细胞活力，大大缩短了原代培养时间。因此，国内外大都采用酶消化法。袁源等[7]用1g/L的胶原酶Ⅳ，37℃持续搅拌消化30min，随即用1g/L的胰酶37℃持续搅拌消化30min；侯克东等[8]则是采用0.75g/L的胶原酶Ⅰ，在37℃磁力搅拌器作用下消化10～14h；PEREIRA等[9]采用3g/L的胶原酶Ⅰ，37℃磁力搅拌器作用下消化3h。文献报道通过胶原酶与透明质酸酶混合使用能够降低消化液的粘附及缩短消化时间，其中胶原酶Ⅱ消化能力较其他类型的胶原酶要强[1]。

　　本实验采用1g/L胶原酶Ⅱ，于37℃恒温震荡仪内消化分离人脐带MSCs，消化至Wharton胶全部消化，时间4～6h不等。消化过程中加适量的DMEM。消化完毕后采用100目的细胞筛过滤，离心后收集细胞接种于培养瓶。消化采用此种方法所培养的细胞在体外成集落样生长，细胞生长性状稳定，增殖速度快，贴壁时间短，贴壁细胞成活率高。

　　目前尚未明确hUCMSCs的特异性抗原标志，通常以细胞形态、流式细胞检测结果、多向分化潜能作为判断标准[10]。本研究分离纯化得到的脐带间充质干细胞具有贴壁生长的特性，形态类似成纤维细胞，流式细胞仪检测高表达间质细胞标志CD29、CD44、CD105，不表达造血系标志CD34、CD45和人白细胞抗原HLADR。经成骨和成脂诱导培养基诱导后，通过ALP染色以及茜素红染色证实分化为成骨细胞，通过油红O染色证实分化为脂肪细胞。因此，根据目前比较广泛的可被大多数研究者接受的鉴定标准，我们从人脐带中获取的这些细胞即是间充质干细胞。
　　
　　综上所述，本实验建立了一套体外稳定培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，所培养的细胞成分单一、扩增迅速、生物学性状稳定，并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化，为其进一步应用于组织工程和细胞治疗提供了实验依据。

参考文献

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　　[8]侯克东，许文静，张莉，等. 人脐带Wharton胶中间充质干细胞向软骨诱导的实验研究 [J]. 中华骨科杂志， 2007， 27(12):930935.

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