小反应体积实时定量PCR的可行性评价

　　　　 作者：韩燕，朱文华，何晓静，蒋丛姗，宁启兰，吕社民，孟列素

【摘要】 　　目的 从扩增稳定性、扩增效率以及可靠性等多方面评估实时定量PCR(RtPCR)反应小体积的可行性，同时确定适合小体积体系的模板量。方法 将实验分为10、15、20μL 3个体积组，每组分别采用0.1、0.2、0.3、0.4μL的大鼠cDNA为模板，进行大鼠βactin mRNA的RtPCR扩增。通过扩增曲线和熔解曲线考察反应的稳定性，以梯度模板拟合标准曲线获得反应的扩增效率，其线性相关程度反映模板量是否合适。另外，构建大鼠降植烷诱导的关节炎(pristaneinduced arthritis， PIA)模型，采用选定的反应体系，分别对模型组和正常组大鼠脾脏TNFα mRNA进行扩增，通过TNFα的相对表达趋势反映小体积扩增的可靠性。结果 在大鼠βactin mRNA的RtPCR扩增中，10、15、20μL 3个体积组均能特异稳定地进行扩增，并保证高扩增效率。而且每个体积组中的模板梯度表现出很好的线性相关趋势。同时选用10μL和20μL反应体积、0.2μL模板对关节炎大鼠脾脏进行TNFα mRNA扩增，结果一致表现出了预期的显著性上调。结论 实验证实10μL、15μL等小反应体积应用于RtPCR扩增中是可行的，具有较好的稳定性和可靠性，同时0.1～0.4μL cDNA模板在3种体系的合适模板范围内。这种较小的PCR反应体积，不仅节省了试剂和实验材料，对一些来之不易的临床标本尤为重要，也利于高通量大规模的RtPCR检测的实现。

【关键词】 实时定量PCR；小反应体积；稳定性；可靠性

　　ABSTRACT: Objective To evaluate the feasibility of realtime quantitative PCR (RtPCR) with small volume regarding the stability， efficiency and reliability of amplification， and determine the optimal quantity of cDNA template suitable for small PCR volume. Methods The experiment was carried out in 3 groups with 10， 15 and 20μL reaction volume， respectively. In each group， rat βactin mRNA was detected by RtPCR with 0.1， 0.2， 0.3 or 0.4μL rat cDNA as template， respectively. The amplification curve and melting curve were used to evaluate the reaction stability. The fitting of a curve of gradient templates against threshold cycle numbers was to show the reaction efficiency and the linear correlativity was to estimate the suitability of the template quantity. In addition， in order to estimate reliability， pristaneinduced arthritis (PIA) rat model was established， and spleen TNFα mRNA expression was detected by RtPCR with the selected reaction volumes. Results The amplification of rat βactin mRNA was specific and stable in 10μL， 15μL and 20μL PCR volume， and had a high efficiency. Furthermore， the standard curves fitted by 0.1-0.4μL gradient templates showed a significant linear correlation in each volume group. When the 10μL and 20μL PCR volumes， and 0.2μL cDNA templates were chosen， the TNFα mRNA expression in PIA rat spleen showed significant upregulation in both two volume groups as anticipated. Conclusion The experiment shows that it is feasible in the RtPCR amplification to use the small reaction volume of 10μL and 15μL， which has good stability and reliability. And 0.1-0.4μL templates are all suitable for the reaction system. PCR with small volume can not only save the reagents and template， especially rare clinical specimens， but also is helpful for the realization of highthroughput reaction.

　　KEY WORDS: realtime quantitative PCR; small reactive volume; stability; reliability

　　实时定量PCR(realtime quantitative PCR， RtPCR)因具有对PCR扩增实时监控、扩增后无需后续操作、更加便利的多重扩增等优势，在近些年的生命科学研究中被广泛应用[12]。当前比较常用的RtPCR法包括通过荧光探针标记的Taqman探针技术、分子信标技术[34]和用荧光染料掺入的SYBR Green I染料法[56]。

　　实验结果准确、可重复是对包括RtPCR在内的所有PCR反应的基本要求，因此PCR的体系必须相对的稳定，其中反应的体积尤为重要。体积过大，浪费模板和试剂，不利于大规模的基因检测；相反小体积节约实验材料，特别是一些珍贵的临床标本，实验流程更加快捷，比较适合96孔、384孔等整板高通量大规模的检测，但是过小的反应体积往往由于荧光强度较低而造成差异检出度低、假阴性等。因此合理的反应体系、合适的模板量结合较小的反应体积，不仅可以保持反应的高精确性，也能够节约试剂和模板，使RtPCR的高通量检测更易实现。在本实验中，我们基于SYBR Green I染料法，采用10、15、20μL的反应体积，摸索可行的小反应体积条件，并寻找合适的模板量。同时通过检测降植烷诱导的关节炎(pristaneinduced arthritis， PIA)大鼠脾脏TNFα表达水平，来考察反应体积的可靠性和敏感性。

　　1 材料与方法

　　1.1 大鼠脾脏总RNA的提取及cDNA的合成

　　DA大鼠经20g/L戊巴比妥钠麻醉后处死，获得脾脏组织，液氮速冻保存。剪取100mg脾脏组织，在研钵中加液氮研磨至粉状后，加入1mL TRIzol试剂(Invitrogen)，按照TRIzol试剂盒说明进行总RNA抽提。经RNA完整性检验和纯度检验后，取5μg总RNA，按照第一链cDNA反转录试剂盒(MBI)说明进行cDNA的合成。获得的cDNA -20℃保存备用。

　　1.2 RtPCR体系体积评估

　　实验分为3组：10μL、15μL和20μL体系组。各组又分为4个梯度模板组，分别加入正常DA大鼠脾脏cDNA 0.1、0.2、0.3和0.4μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (TaKaRa，工作浓度为1×，用量为反应体积的一半)，和500nmol/L的大鼠βactin上下游引物(AugCT公司合成，表1)，以水补足体积。实验耗材统一选用96孔PCR板(PCR96FLTC， Axygen)，通过实时定量仪(IQ5，BioRad)进行大鼠βactin mRNA的PCR扩增。扩增条件为95℃ 5s，60℃ 15s，72℃ 30s，共40个循环。IQ5 Optical System Software给出所得扩增曲线、熔解曲线和拟合标准曲线及相应的参数值。

　　1.3 PIA模型TNFα mRNA的检测

　　将16只关节炎易感的DA大鼠随机分为2组，雌雄匹配。模型组每只尾根部皮下注射150μL降植烷(pristane， ACROS)，正常组注射150μL生理盐水[7]。26d后处死大鼠，获得脾脏组织，液氮中保存。按照上述方法进行总RNA抽提和cDNA合成。RtPCR采用10μL和20μL体系，每种体系0.2μL模板，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，工作浓度为1×，用量为反应体积的一半)和500nmol/L的大鼠TNFα或者βactin上下游引物(AugCT公司合成，表1)，以水补足体系。通过实时定量仪(IQ5，BioRad)进行PCR扩增。扩增条件为95℃ 5s，60℃ 15s，72℃ 30s，共40个循环。IQ5 Optical System Software计算出最终的各组相对表达值。

　　1.4 统计学分析

　　标准曲线相关性分析由IQ5分析软件完成。TNFα基因相对表达数据以平均值±标准误表示，通过STATVIEW软件的ANOVA进行多因素方差分析以及t检验进行两组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。表1 RtPCR引物信息（略）

　　2 结 果

　　2.1 小体积体系稳定性和最适模板范围的评估

　　实验分10、15、20μL(对照)共3个体系组，采用大鼠脾脏cDNA为模板，每个体系下设4个模板量，依次为0.1、0.2、0.3、0.4μL，选用商业化的实时定量PCR试剂盒(即荧光染料、酶、dNTP、缓冲液等的混合液)以排除体系的差异，加入大鼠βactin引物进行扩增。
　　
　　扩增曲线(图1A)和熔解曲线(图1B)显示βactin mRNA的PCR扩增正常。3个反应体积及其对应的各模板组扩增的平均Ct值如表2所示。在各自的反应体积下，随模板量的增加Ct值递减；在相同模板量条件下，Ct值随反应体积的增大而减小。由各组Ct值对应的CV值(表2)可知，组内复孔扩增一致性较好，同时10、15、20μL组的扩增效率分别为99%、131%、88%(表2)，小体积组效率较高，可见这3个体系组在扩增过程中都具有较好的稳定性。IQ5软件通过每个体系4个模板梯度的Ct值拟合出各自的标准曲线(图1C～图1E)，并计算出反映相关度的R2(表2)，10、15、20μL组的R2分别为0.959，0.946，0.972，都显示出了高相关性，说明0.1～0.4μL模板在3个体系的线性扩增范围内。表2 采用不同反应体积和模板量的RtPCR扩增βactin mRNA的参数（略）

　　2.2 小体积体系可靠性的评估

　　构建大鼠的PIA模型，分别获得模型组和正常组脾脏组织cDNA作为模板。基于上述结果，我们选择10μL和20μL(对照)体系0.2μL模板分别进行大鼠TNFα mRNA的RtPCR扩增。多因素方差分析显示，疾病情况不同(即模型组与正常组)TNFα mRNA表达存在差异(P<0.05)，而体系体积不影响TNFα mRNA的表达差异(P>0.1)；同时疾病情况与体系体积两种因素为独立事件，没有交互作用(P>0.1)。在两种反应体积各自条件下，模型组TNFα mRNA都一致表现出显著性上调，其中10μL体系模型组表达较正常组升高2.7倍(P<0.01)，20μL组升高4.1倍(P<0.05，图2)，与预期相符。实验重复3次，趋势一致，说明10μL反应体积进行PCR扩增有很好的可靠性。

　　3 讨 论

　　1983年，MULLIS发明了PCR技术，被认为是20世纪生物技术领域的重大革新。在短短的20多年应用中，PCR技术以其在核酸分子定性、定量研究中的高特异性、敏感性、精确性等优势，推动着生命科学突飞猛进的发展，而PCR技术本身也在不断的更新和完善。90年代中后期，RtPCR技术由美国Applied Biosystems公司推出，其实时监控等诸多优势使其倍受青睐。我们在NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上以“real time PCR”为检索词检索，到2000年仅有165篇文章，而在2008年就有3765篇文章发表。这当中应用最多的还是基因表达的定量分析，包括用内参基因校正的相对定量和用基因标准进行的绝对定量，这种基因表达的量化，为基因功能、系统发育的研究和疾病诊断提供了有效的工具。另外，RtPCR技术还广泛应用于基因分型、单核苷酸多态性分析、等位基因辨别和遗传变异分析等[8]。

　　受传统的PCR的影响，RtPCR目前其反应体积主要为50μL和100μL，偶见20μL或25μL。这使得很多珍贵的临床材料没有最大限度的在实验中利用，同时也浪费了反应试剂，对96、384孔板等整板高通量反应的进行也造成了困难。我们在研究中，将RtPCR的反应体积减小至10μL和15μL，并从反应过程的稳定性、结果的可靠性对其可行性进行评估。在对大鼠βactin基因的扩增中，各体积组扩增曲线平滑完好，熔解曲线显示扩增片段特异，平行样变异较小，提示反应稳定，有良好的可重复性；我们选用0.1～0.4μL的梯度模板，通过拟合的相关曲线显示其线性相关度较好，扩增效率较高，各模板都在体系的合适范围内。TNFα作为一种促炎性细胞因子，被认为是类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)的关键靶点之一，它在RA患者以及多种RA的动物模型中都被检出高的表达水平[9]。通过RtPCR测定细胞因子基因的表达技术已经十分成熟[10]，我们采用10μL体积的反应体系，对关节炎模型大鼠脾脏TNFα mRNA扩增，与正常大鼠相比表现出显著的上调，这与20μL反应体积结果一致，显示出PCR扩增在基因表达检测等实际应用中的可靠性。
　　
　　综上可见，10、15μL等小反应体积的RtPCR扩增具有较好的稳定性和可靠性，同时0.1～0.4μL cDNA模板在其体系的合适模板范围内。采用这种较小的反应体积的RtPCR是可行的，这为RtPCR的检测应用具有方法学的指导作用，使得PCR扩增更加的便利化、节俭化、通量化。

参考文献

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