臀肌挛缩症发病过程中TGFβ1和HSP47的表达及其作用

　　　　 作者：赵晨光，贺西京，陆斌，李浩鹏

【摘要】 　　目的 探索转化生长因子β1(transforming growth factorsβ1， TGFβ1)和热休克蛋白47(heat shock protein， HSP47)在臀肌挛缩带中的表达情况及其对臀肌挛缩症(gluteal muscle contracture， GMC)发病的作用。方法 收集臀肌挛缩症患者挛缩带和病变旁肌肉的病理标本，运用逆转录－聚合酶链式反应(RTPCR)、免疫组化和Western blot技术检测TGFβ1和HSP47在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。结果 TGFβ1和HSP47定位于成纤维细胞和血管内皮细胞的胞质中，并且呈强阳性表达，其在mRNA水平分别上调了8.1和3.6倍(P<0.05)。蛋白水平的表达情况与mRNA一致，分别上调11.2倍和7.6倍(P<0.05)。结论 TGFβ1和HSP47的表达上调可能是引起挛缩带产生的重要机制。

【关键词】 臀肌挛缩症；纤维化；TGFβ1；HSP47

　　ABSTRACT: Objective To explore the expression and effect of transforming growth factorsβ1 (TGFβ1) and heat shock protein (HSP47) on gluteal muscle contracture (GMC). Methods We collected contraction band and adjacent muscle from GMC patients and explored the expression of TGFβ1 and HSP47 using immunohistohemistry， reverse transcription and polymerase chain reaction (RTPCR)， and Western blot analysis. Results TGFβ1 and HSP47 were intensely expressed in fibroblast cells and vascular endothelial cells. The expression of them increased 8.1fold and 3.6fold at the mRNA level， respectively (P<0.05). The same changes were found at the protein level， which increased 11.2fold and 7.6fold， respectively (P<0.05). Conclusion Upregulation of TGFβ1 and HSP47 may initiate fibrotic cascade in the gluteal muscles of GMC patients.

　　KEY WORDS: gluteal muscle contracture; fibrosis; TGFβ1; HSP47

　　臀肌挛缩症(gluteal muscle contracture， GMC)是由多种病因引起的臀部肌肉及其筋膜组织的变性、坏死及纤维化性病理改变，是以多种髋关节活动障碍为主要临床表现的综合症[1]。成纤维细胞持续增生并活化，进而引起胶原过度分泌和沉积是引起瘢痕挛缩带形成的主要病因。转化生长因子β1(transforming growth factorsβ1， TGFβ1)是TGFβ家族成员，广泛表达于人体各种细胞内，参与细胞的生长分化、组织器官的胚胎发育等重要生命过程。TGFβ1不仅可以单独增加细胞胶原分泌，更可以通过上调其他多种细胞因子而间接地起到促纤维化作用，是目前较为肯定的与组织纤维化有密切关系的细胞因子[23]。热休克蛋白47(heat shock protein， HSP47)存在于胶原蛋白分泌细胞的内质网内，是胶原特异性分子伴侣，可以在前胶原折叠、组装和分泌时短暂地与之作用并对成熟胶原分泌产生影响[4]。TGFβ1和HSP47已被证实与肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化以及皮肤纤维化等多种纤维化疾病的发病有密切关系，为此，本实验选择TGFβ1和HSP47作为研究对象，采用逆转录－聚合酶链式反应(RTPCR)、免疫组化和Western blot技术观察它们在臀肌纤维化疾病中的表达及分布规律，以探讨它们在挛缩带形成过程中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本来源

　　取材来自于西安交通大学医学院第二附属医院骨二科住院进行臀肌挛缩症松解术的23例臀肌挛缩症患者，年龄7～27岁(10男，13女)，平均年龄18.6岁。取材包括挛缩带及病变周围正常臀大肌组织。取材后每份组织等分两份，一份组织用生理盐水冲洗干净后置于冻存管内放入液氮中存储，另一份组织置于中性甲醛中固定脱水，石蜡包埋，切片后备用。

　　1.1.2 主要材料

　　Trizol购自美国Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司，TGFβ1 及 HSP47引物由北京奥科公司合成，TGFβ1上游引物：5′GGCCAGATCCTGTCCAAGC3′，下游引物：5′GTGGGTTTCCACCATTAGCAC3′，PCR产物长度：201bp；HSP47上游引物：5′GCACTGCGGAGAAGTTGAG3′，下游引物：5′ATGACACCCACGGTATAGGAC 3′，PCR产物长度：613bp；βactin上游引物：5′ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG3′，下游引物：5′AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG3′，PCR产物长度：179bp。TaKaRa Ex Taq HS Mix购自大连宝生物公司，TGFβ1及HSP47单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SAP染色试剂盒购自美国Vector 公司，复合蛋白酶抑制剂Cocktail购自美国Roche公司，ECL发光试剂盒购自美国Pierce公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 RTPCR检测TGFβ1及HSP47蛋白mRNA的表达

　　标本从液氮取出后，用Trizol按说明常规提取组织中RNA并定量，按RNA逆转录试剂盒使用说明进行反转录，然后进行PCR扩增。采用50μL反应体系，含模板5μL，正向外引物1μL，反向外引物1μL。扩增条件为：94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物在80V、50min条件下经20g/L琼脂糖凝胶电泳显示结果，用IMAGEPRO软件分析灰度值。每一个标本与内参校正后进行比较。

　　1.2.2 TGFβ1及HSP47的免疫组化染色检测

　　蜡块连续切片(厚度4μm)后烘干，置于二甲苯中脱蜡，下行梯度酒精中水化；柠檬酸抗原液中进行抗原修复，h3O2阻断内源性过氧化物酶，封闭血清封闭非特异性抗体；用小鼠抗人TGFβ1(1∶400)和HSP47(1∶400)孵育过夜。SAP染色试剂盒常规显色，光镜观察，结果以胞质或/和胞核着红色者为阳性染色。另用PBS代替一抗为阴性对照。

　　1.2.3 TGFβ1及HSP47蛋白的Western blot检测

　　标本从液氮取出后加1mL裂解液和20μL Cocktail，研磨并高速低温离心，取上清液测蛋白浓度。变性后每孔加20μg样本经100g/L浓缩胶及分离胶80V垂直电泳，转膜、封闭加一抗4℃过夜。洗膜加二抗37℃孵育2h，再洗膜加化学发光剂显影，照相，用IMAGEPRO软件分析灰度值。标本与内参校正后进行比较。

　　1.2.4 统计学分析

　　计量资料以±s表示，应用SPSS 13.0对数据进行统计分析。统计方法采用配对样本的t检验(对差值进行正态性检验均满足正态性)，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 TGFβ1和HSP47的mRNA表达

　　患者手术标本经过RNA提取及逆转录-聚合酶链式反应，TGFβ1的mRNA在挛缩带中的表达量(8.1483±0.2850)明显高于病变旁臀大肌的表达量(1.0270±0.1430)，HSP47的mRNA在挛缩带中的表达量(3.6074±0.1619)明显高于病变旁臀大肌的表达量(1.0574±0.1274)，(P<0.01，图1)。

　　2.2 TGFβ1和HSP47的免疫组化观察

　　TGFβ1和HSP47的表达均定位于细胞质，为红色颗粒，呈弥漫性分布，其在成纤维细胞和血管内皮细胞中呈强阳性表达，而挛缩带旁的臀大肌组织的TGFβ1和HSP47表达量非常少(图2)。

　　2.3 Western blot检测TGFβ1和HSP47的蛋白表达

　　患者手术标本经过蛋白提取及Western blot检测，TGFβ1和HSP47条带分别出现在25ku、47ku位置。经灰度分析，发现TGFβ1蛋白在挛缩带中的表达量(11.2145±0.3914)明显高于病变旁臀大肌的表达量(1.0924±0.1823)，HSP47在挛缩带中的表达量(7.6902±0.2735)明显高于病变旁臀大肌的表达量(1.0384±0.1387)，(P<0.01，图3)。

　　3 讨 论
　　
　　臀肌挛缩症发病过程中挛缩带的形成是一个复杂的过程，涉及临床和基础医学许多领域。挛缩带形成的主要过程是成纤维细胞活化进而增殖并分泌以胶原为主要成分的胞外基质，最后这些物质大量沉积引起挛缩造成髋关节功能障碍。可见胶原过度生成是臀肌挛缩症发病的关键所在。

　　转化生长因子β(transforming growth factorβ， TGFβ)是一类具有多种生物学功能的多肽类细胞因子，广泛表达于人体各种细胞内。迄今为止，所有发现的TGFβ是由许多具有共同生物学特性的信号分子组成的大家族，称为TGFβ超家族(transforming growth factorβ superfamily)。TGFβ超家族至少由40种细胞因子组成，并可以划分为不同的亚家族，其中包括：TGFβ亚家族，抑制素亚家族，激活素亚家族等[5]。HSP47是一种最先从鼠类内胚层细胞中分离出来的蛋白质，它可以和多种胶原亚型结合，是胶原的特异性分子伴侣。胶原的成熟需要经历一系列的过程，其中最为重要的一点就是空间构型的转变，而这一过程正需要HSP47的参与[67]。它可以与细胞内的前胶原结合，协助其进行折叠、组装并且从内质网脱落而成熟。大量的研究表明TGFβ1和HSP47与多种纤维化疾病有密切的联系，在人类的皮肤创伤瘢痕愈合、肝纤维化、肺纤维化、肾小管纤维化以及粥样硬化疾病中都发现有TGFβ1和HSP47高表达的现象，随后在许多活体内、活体外实验中证实阻止或者是下调TGFβ1和HSP47的表达水平可以延缓纤维化的病情发展[8]。

　　本研究发现，TGFβ1和HSP47在挛缩带中均呈强阳性表达，并且主要表达于成纤维细胞和血管内皮细胞中。在臀肌挛缩带中以上二者在mRNA水平都有显著性表达上调(P<0.05)，蛋白水平的表达结果与mRNA水平一致，也呈现出表达上调的趋势(P<0.05)，这与以往其他组织纤维化相关的研究报告结果是一致的。这样的结果提示在挛缩带形成的过程中，TGFβ1和HSP47通过其各自的促纤维化作用，在臀肌损伤修复中促使成纤维细胞增殖、胶原成熟加快并使得其大量分泌到细胞外而导致挛缩带形成。此外，TGFβ1和HSP47的表达上升是具有一致性的，结合以往对TGFβ1和HSP47的研究结果来看，我们认为TGFβ1在臀肌挛缩症中促进挛缩带形成的作用有可能是通过上调HSP47来完成的。

　　综上所述，我们的研究结果有助于推动臀肌挛缩症中挛缩带形成机制的阐明，本实验中所提示的TGFβ1和HSP47的表达上调可能是导致挛缩带形成的原因，这也为今后生物学预防及治疗提供了参考依据。

参考文献

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　　[3]BLOBE GC， SCHIEMANN WP， LODISH HF. Role of transforming growth factor beta in human disease [J]. N Engl J Med， 2000， 342(18):13501358.

　　[4]TAGUCHI T， RAZZAQUE MS. The collagenspecific molecular chaperone HSP47: is there a role in fibrosis [J]. Trends Mol Med， 2006，13(2):4553.

　　[5]MASSAQUE J. How cells read TGFbeta signals [J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 2000， 1(3):169178.

　　[6]NAGATA K. Hsp47: A collagenspecific molecular chaperone [J]. Trends Biochem Sci， 1996， 21(1):2326.

　　[7]KOIDE T， ASO A， YORIHUZI T， et al. Conformational requirements of collagenous peptides for recognition by the chaperone protein HSP47 [J]. J Biol Chem， 2000， 275(36):2795727963.

　　[8]SHAH M， FOREMAN DM， FERGUSON MW. Neutralisation of TGFbeta 1 and TGFbeta 2 or exogenous addition of TGFbeta 3 to cutaneous rat wounds reduces scarring [J]. J Cell Sci， 1995， 108(3):9851002.