兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究

　　　　 作者：张晨，王坤正，强辉，时志斌，党晓谦，黄向辉

【摘要】 　　目的 体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能。方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法，体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞，培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性，HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定；应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性。结果 体外实验成功分离培养兔BMSCs，HE染色显示细胞均一性好；CD44强阳性表达，CD34阴性表达。诱导成骨结果显示BMSCs具有较强的成骨活性，ALP染色阳性；成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性，油红“O”脂肪染色阳性。结论 BMSCs体外具有潜在的多向分化能力。

【关键词】 骨髓基质干细胞；细胞培养；多向分化

　　ABSTRACT: Objective To observe the effect of the in vitro isolation， culture and identification of rabbit bone marrowderived mesenchymal stem cells (BMSCs) and explore the differentiation potentials of BMSCs. Methods BMSCs were isolated and purified by density gradient centrifugation combined with attachment culture method. The biological characteristics of BMSCs were observed under an inverted microscope. The BMSCs were identified with HE staining and CD34/CD44 immunohistochemical staining. The biological activity of BMSCs was detected by osteogenic induction and steatogenic induction. Results BMSCs were isolated successfully in vitro and had good homogenicity. Immunohistochemical staining of CD34/CD44 showed strong positive expression of CD44 and negative expression of CD34. Fortis osteogenic ability and positive staining of ALP could be detected by osteogenic induction， and fortis steatogenic ability and positive staining of axungia could be detected by steatogenic induction. Conclusion BMSCs have the capability of multidirectional differentiation in vitro.

　　KEY WORDS: bone marrowderived mesenchymal stem cell; cell culture; multidirectional differentiation

　　基因治疗过程中目的基因感染的靶向性成为基因工程研究的关键环节，选取何种目的细胞、组织作为基因感染的效应器是众多研究的核心。骨髓间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells， BMSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化能力的干细胞，在特定条件下可以向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱、脂肪细胞等分化。将编码与骨组织再生有关的生长因子的基因片段转移到BMSCs中，既能够诱导其向成骨细胞转化，使之发挥种子细胞的作用，又能在体内骨组织再生过程中持续高效地分泌生长因子，有利于骨组织的再生修复和新骨形成。因此，将其作为基因治疗宿主细胞以及组织工程种子细胞已成为当前研究的热点。
　　
　　本实验应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法，体外分离培养兔骨髓来源的BMSCs，培养过程中应用相差显微镜及HE染色观察细胞的贴壁、扩增、形态、生长速度及群体生长方式等特征，利用细胞表面抗原免疫组化染色鉴定及诱导成骨、成脂鉴定等方法鉴定培养的BMSCs的特征及纯度，为后续实验提供充足的靶细胞支持。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　2月龄纯种新西兰大耳白兔，雄性，体重1.5～2.5kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。胎牛血清、低糖DMEM培养基(LGDMEM)、胰蛋白酶、Percoll分离液(1.073g/mL)购自美国Gibco公司；CD34、CD44羊抗兔单克隆抗体、鼠抗羊IgGFITC二抗购自美国Santa Cruz公司；β甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松购自美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 兔BMSCs的分离与培养

　　采用全骨髓密度梯度离心法合并贴壁培养法培养BMSCs[3]。取兔的胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液洗去附着的血迹，将其两端干骺端切除，显露骨髓腔。用含有100u/L肝素的生理盐水反复冲洗骨髓腔，将含有骨髓的冲洗液用DMEM培养基稀释后，以等体积比缓慢注入装有已滤菌的Percoll(1.073g/mL)分离液的10mL离心管中，室温下2000r/min离心30min。小心吸取单个核细胞层加入DMEM低糖培养液中，1200r/min离心10min，反复两次，洗净细胞悬液中的Percoll分离液。用含100mL/L FBS的DMEM低糖培养液5mL重悬细胞，按1×106个细胞/cm2接种于25cm2培养瓶中，置于37℃、50mL/L CO2饱和湿度孵育箱中行原代培养。48h换液，弃去未贴壁细胞，此后每3d换液1次。原代培养细胞12d后细胞达80%融合，用2，5g/L胰酶消化后以1∶3的比例传代培养。取第3代细胞行下游相关实验。

　　1.2.2 兔BMSCs的形态学观察

　　细胞培养过程中，应用相差显微镜逐日观察体外培养的BMSCs的生长状态及形态学变化，记录细胞贴壁、扩增、细胞形态、生长速度、群体生长方式等特征。将第3代细胞常规制备细胞爬片，950mL/L乙醇固定行HE染色，光学显微镜下观察BMSCs的形态、结构并照相记录。

　　1.2.3 兔BMSCs的细胞免疫化学鉴定

　　以1×105细胞密度常规制备细胞爬片，至细胞长满玻片的80%左右，吸出6孔板中的培养液，PBS冲洗两遍，每孔加入新配制40g/L多聚甲醛溶液固定30min。PBS洗涤后30mL/L h3O2室温10min以灭活内源性酶，正常山羊血清封闭液室温孵育30min后分别滴加羊抗兔CD34、CD44一抗，对照组以PBS代替一抗。4℃孵育过夜。次日37℃复温1h，采用SP法检测CD34、CD44的表达。

　　1.2.4 兔BMSCs诱导成骨分化的生物学活性

　　常规制备细胞爬片。待细胞生长融合至40%，加入成骨诱导培养液(LGDMEM中含有100mL/L FBS、青霉素100u/mL、链霉素100u/mL、β甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸50mg/L、地塞米松10nmol/L)进行诱导培养，诱导培养期间应用相差显微镜观察细胞的生长状态及特征。诱导培养3周后行碱性磷酸酶染色及矿化结节染色鉴定细胞成骨活性变化。

　　1.2.5 兔BMSCs诱导成脂分化的生物学活性

　　常规制备细胞爬片。待细胞生长融合至40%，加入成脂诱导培养液(LGDMEM中含有100mL/L FBS、青霉素100u/mL、链霉素100u/mL、0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、200μmol/L吲哚美辛、10umol/L地塞米松、10mg/mL胰岛素)进行诱导培养，诱导培养期间应用相差显微镜观察细胞的生长状态及特征，诱导培养3周后行油红“O”染色鉴定细胞成脂活性的变化。

　　2 结 果

　　2.1 原代培养的BMSCs的观察

　　兔骨髓组织经Percoll分离液梯度离心后可形成明显的分层结构。吸取单核细胞层细胞洗涤后接种，2～4h后细胞开始贴壁，24h后细胞逐渐由圆形变为短梭形、纺锤形、多角形；但仍可见少量造血系细胞悬浮于培养液中或沉积于培养瓶底壁，呈圆形散在分布(图1A)，经首次换液后再次观察大部分非贴壁细胞已经去除。接种4d后可见较明显的细胞集落形成(图1B)，14d左右，贴壁细胞生长至瓶壁的80%左右，将细胞传代，传代细胞形态逐渐呈均一的纺锤形和长梭形，核质比大，细胞分布均匀不再呈集落生长，细胞密度增大后多沿胞体长轴呈有序同向分布，旋涡状。传代细胞增殖速度更快，一般4～5d可长满培养瓶底部，传代1次(图1C)。

　　2.2 原代培养的兔BMSCs的鉴定

　　光学显微镜下HE染色可见：细胞形态规则，大部分呈长梭形，胞质丰富为淡红色，细胞核多为卵圆形核浆，分界清晰，位于胞体膨大部的中央，呈蓝色，其中可见处于分裂期的核仁。细胞形态与BMSCs形态一致(图2A)。以已知CD34、CD44阳性片为阳性对照组，以PBS代替一抗作为阴性对照组，观察到CD44表达于细胞的细胞质中，呈现棕黄色，CD34及阴性对照组无表达。CD44阳性细胞百分数为91.78%(图2B、2C)。

　　2.3 诱导成骨分化的相差显微镜观察鉴定

　　用成骨细胞条件培养液诱导培养原代细胞，培养20d后进行ALP染色(Gomori钙钴法)鉴定，可见诱导培养组细胞胞质内出现阳性反应，呈现灰黑色颗粒；常规培养组细胞胞质内少见灰黑色颗粒(图3)。茜素红染色鉴定可见诱导培养组细胞形成粗大的钙化结节，常规培养组没有钙化结节的形成或仅有散在的钙盐颗粒形成(图4)。

　　2.4 诱导成脂分化的相差显微镜观察鉴定

　　在成脂肪诱导后，细胞原来的多角形突触逐渐回缩，但仍呈多角形，7～9h时出现明显脂滴，脂滴多位于细胞边缘(图5A)。诱导14h后，脂肪细胞增加，细胞内脂滴密布，多数细胞形态变圆，多散在分布。油红“O”染色为阳性(图5B)。

　　3 讨论

　　BMSCs是一种具有多向分化潜能的干细胞，在不同理化环境和细胞因子诱导下，可向成骨、成软骨、脂肪和纤维细胞系等多方向分化分离、扩增，并易于被外源基因感染且稳定表达，是基因治疗以及组织工程理想的靶细胞[12]。体外如何获取、纯化BMSC并使其高效快速增殖，是利用其治疗疾病的前提。细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSCs的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养以其经济实用、操作简便的特点仍是分离 BMSCs的最基本方法。

　　目前用于分离BMSC的方法主要有3种：①贴壁筛选法：根据BMSC具有在塑料组织培养瓶中快速贴壁生长的特性对其进行筛选；②密度梯度离心法：根据BMSC与其他细胞密度不同而采用Percoll分离液进行密度梯度离心将其分离出来；③磁珠分选法：利用免疫磁珠分离技术，基于抗体对细胞表面抗原的特异识别，将偶联在抗体上的磁珠标记在细胞上，在磁场作用下达到分离细胞的目的。单纯应用某一种方法均具有一定得局限性。贴壁筛选法尽管实验方法简单，但是获得的细胞纯度低，不能满足组织工程的要求。研究发现，密度梯度离心法所获得的细胞生长优于全骨髓贴壁筛选法[3]。但是我们通过实验发现，单纯应用密度梯度离心法获得的细胞数目较少，原代培养时间延长。磁珠分选法尽管分离纯度高，但因其需要较高的实验条件及其成本较高等限制了该方法的普遍应用。

　　本实验采用密度梯度离心和贴壁筛选相结合的方法，取得了理想的分离效果。由于原代取材抽取的骨髓血包含大量血系细胞和少量基质细胞，通过梯度离心的方法先对骨髓进行分离，可以将绝大部分红细胞、脂肪细胞和血小板去除，获得纯度较高的单个核细胞。提取单个核细胞层细胞培养24h待大量细胞贴壁后，再提前进行换液结合使用贴壁筛选，经过多次换液后即能去除培养瓶内悬浮未贴壁的造血细胞，从而获得均一性较好的BMSCs。随着换液与传代，BMSCs逐渐得到进一步纯化。目前较常用的分离液有Percoll液、淋巴细胞分离液等。PITTENGER等[4]利用流式细胞仪检测密度梯度培养的第1代和第2代的BMSCs的均质性可达95%和98%。随着细胞传代数目的增多，非贴壁细胞逐步去除，基质干细胞的纯度也逐步升高，一般认为该方法分离培养的BMSCs纯度大于70%[5]。

　　到目前为止，还没有高度特异性的BMSCs细胞表面标记物被发现，故无法直接对其鉴定。对BMSCs的鉴定主要是采用流式细胞仪对其表面抗原进行检测，再通过其能向其他细胞分化而反证。PITTENGER[4]认为称某种或某一群细胞为BMSCs时，它必须具有以下特性：①骨髓来源；②体外培养贴附于培养皿上形态呈成纤维样集落形成单位(CFUF)；③能够自主增殖，至少可以分化为3种以上间质细胞系。BMSCs的细胞表面标记是其与其他细胞区分的特异性标志。通过众多研究结果的筛选[510]，发现骨髓来源的CD44表面标记的阳性表达与造血系来源的CD34表面标记的隐形表达是较为肯定的结论。因此，本实验应用免疫组化方法对二者进行了染色鉴定，结果证实了CD44分子的强阳性表达和CD34分子的阴性表达。该结果说明本实验获得的目的细胞纯度较高，能满足下游实验的要求。
　　
　　BMSCs具有多向分化潜能，在体外培养时，为了使BMSCs向成骨细胞定向分化，常通过理化或生物因子等手段促进BMSCs的增殖与分化，其中以生物因素最重要和最常用。地塞米松(Dex)虽抑制BMSCs增殖，但可显著增加BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)的活性，从而促进成骨细胞的分化成熟、诱导成骨。β甘油磷酸钠可为骨细胞分化和增殖提供磷离子作为碱性磷酸酶作用的底物，诱导和激活碱性磷酸酶，促进有机磷向无机磷转化，能增加ALP在成骨细胞中的表达，从而促进生理性钙盐的沉积、促进钙化；维生素C可提高ALP的活性、促进矿化及胶原mRNA的表达[11]。因此，本实验采用含100mL/L FBS、100nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ磷酸甘油酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养液，诱导细胞向成骨方向转化。本实验所培养的BMSCs经诱导成骨后，在相差显微镜下观察，呈梭形或多角形，具有多个突起，采用Gomori钙钴法ALP染色鉴定显示，ALP分泌旺盛，成骨性能增强，3周后形成钙结节样结构，表现出典型的成骨细胞特性。向生长状态良好的第3代BMSCs中添加了脂肪细胞诱导剂(胰岛素、地塞米松以及异丁基甲基黄嘌呤)，发现作用1周后成纤维细胞样细胞的突触逐渐回缩，细胞形态逐渐由梭形向椭圆形、多角形转变，胞质内出现了数量不等的脂肪滴，聚集在细胞核周围，两周后油红“O”染色呈阳性反应。证实了BMSCs在脂肪细胞诱导剂作用下实现了向脂肪细胞的定向分化。

　　本实验应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法，体外分离培养扩增兔骨髓来源的BMSCs，培养过程中相差显微镜及HE染色观察到细胞生长状态良好，细胞表面抗原免疫组化染色鉴定显示获得的目的细胞纯度较高，诱导成骨成脂鉴定显示获得的BMSCs具有典型的干细胞细胞特性。制备具有强增殖能力的BMSCs无疑为组织工程提供了良好的靶细胞支持，提高了组织工程修复组织缺损的能力，为骨坏死及骨缺损等疾病的组织工程治疗奠定了坚实的实验基础。

参考文献

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