陕西关中人群骨质疏松性骨折与细胞色素P450芳香化酶编码基因的关联分析

　　　　 作者：王金堂，武世勋，贾云辉

【摘要】 　　目的 探讨骨质疏松性髋部骨折(osteoporotic hip fracture， OHF)与细胞色素P450芳香化酶编码基因(cytochrome P450c19， CYP19)多态性的关系。方法 采用群体关联分析的方法，对来自陕西关中人群的400例OHF患者和400例正常对照的7个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms， SNP)位点进行了分型实验和单体型的病例对照研究。结果 共700个个体分型成功，haploview关联分析识别出了3个单体域的单体型，并挑选出7个标签SNP。方差分析的结果表明，位于CYP19基因的SNP位点rs643892和rs3781590以及单体域3区多态性与髋部骨折之间存在相关性。结论 细胞色素P450芳香化酶编码基因和我们所研究的陕西关中汉族群体的骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture， OF)发病率关联。细胞色素P450芳香化酶编码基因可能对中国陕西关中汉族人群OHF的发病率有影响。

【关键词】 骨质疏松症；细胞色素P450；单核苷酸多态性；单体型；骨折

　　ABSTRACT: Objective To study the relationship between osteoporotic hip fracture (OHF) and polymorphism of cytochrome P450c19 genes. Methods By using a group correlation analysis， we made a casecontrol study of seven single nucleotide polymorphism (SNP) sites groupinge and haplotype in 400 OHF patients from Shaanxi Guanzhong population and 400 normal samples as controls. Results A total of 700 samples were successfully genotyped. Correlation analysis identified three blocks and selected seven tag SNPs. According to the variance analysis， rs7167343， rs8031463， and polymorphism of haplotype 3 were associated with hip fracture. Conclusion Cytochrome P450c19 genes have association with the incidence of osteoporotic fracture in the Han population we studied from Shaanxi Guanzhong region. Therefore， cytochrome P450c19 genes may affect the incidence of osteoporotic hip fracture in the Han population from Guanzhong region， Shaanxi Province.

　　KEY WORDS: osteoporosis; cytochrome P450c19 (CYP19) gene; single nucleotide polymorphism; haplotye; fracture

　　骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构受损、骨矿物成分和骨基质等不断减少、骨脆性增加和骨折危险度升高为特征的一种全身骨代谢障碍多基因复杂遗传性疾病，遗传率高达50%～90%[1]。骨质疏松症的严重后果是骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture， OF)，以髋部骨折最为严重。本研究选取罹患骨质疏松性髋部骨折(osteoporotic hip fracture， OHF)的老年患者作为研究对象，在排除了继发性骨质疏松症及其他引起骨强度改变的因素后，直接以OF做为研究表型，用基因组对照关联法和结构关联法这两种无偏的统计方法研究雌激素代谢过程中重要的限速酶——细胞色素P450芳香化酶编码基因(CYP19)与OF发生的关系。根据分型结果，我们利用Haploview进行了单体型识别，并对单体型识别的结果进行统计学分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例来源

　　本研究征集了400例大于55周岁的OHF病例(女性246人)和400例大于60周岁的健康人群(女性221人)，所有的研究个体都来自汉族群体，加入研究时都签署了知情同意书，同时经过了严格的排除标准：①严重暴力外伤患者，如车祸致伤患者、高处坠落伤患者、重物击伤患者等；②继发性骨质疏松症患者：既有明确的原发疾病史，又有骨质疏松与骨折的表现等；③双能X线吸收法(DXA)测定骨密度值的结果不符合骨质疏松的诊断标准。④除外骨肿瘤、骨转移瘤、多发性骨髓瘤、继发性骨质疏松症以及其他骨病导致的骨折。⑤严重心肺等重要脏器功能障碍及严重精神疾病者。

　　1.2 试剂及仪器

　　DNA提取所用的试剂盒(百泰克生物公司)、TaqMan通用PCR扩增预混试剂(美国ABI公司)、单核苷酸多态性基因分型试剂(美国ABI公司)、紫外分光光度计(德国Eppendorf公司)、MicroAmp 光学384孔反应板(美国ABI公司)、HT7900实时定量PCR仪器(美国ABI公司)、5810R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、MilliQ超纯水仪(美国Millipore公司)、WH2微型漩涡混合器(上海沪西分析仪器厂有限公司)。

　　1.3 检测方法

　　1.3.1 DNA的提取

　　在装有10mL抗凝全血的离心管中加入30mL红细胞裂解液，室温放置10min。4000r/min离心10min，弃红色上清后留下完整的管底白细胞团和大约50μL OHF残留上清(若离心裂解很不充分，应该重复以上步骤)。涡旋振荡重悬后充分分散白细胞团。加入10mL细胞核裂解液至重悬的白细胞，涡旋振荡几秒混匀以裂解白细胞，立刻停止吹打，颠倒旋转离心管。加入蛋白沉淀液，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀。4000r/min离心10min。用枪头将中间层的DNA液吸取到含10mL异丙醇的离心管中并轻轻混匀。将DNA吸取到Eppendorf离心管，用酒精清洗后离心，去除酒精、干燥。干燥后加入100μL DNA溶解液，脱色摇床上混匀24h。DNA液于-70℃以下保存。

　　1.3.2 DNA点样及准备反应板

　　①DNA稀释：测定DNA的浓度，用无菌水稀释DNA至20ng/2.25μL。②准备反应预混试剂：每个反应孔的反应预混试剂的L体积为2.75μL。③点样：吸取2.75μL的反应预混试剂对应加入384反应板中的反应孔中；1～21号孔中，A至 P依次加入SNP116对应的反应预混试剂。吸取2.25μL的溶液加入指定反应孔：反应孔1～20(A至P)加入对应的样本DNA，21(A至P)加入无菌水。21(A至P)为无模板对照(NTC)。NTC显示背景信号并用作阴性对照。整个点样的过程都在冰上进行，每个反应孔的最终体积均为5μL。④完成点样后，用平板高透光度盖膜覆盖反应板，1000r/min离心2min，在微型漩涡混合仪上点振，再1000r/min离心2min，消除反应板孔中气泡。将反应板装入HT7900中。

　　1.3.3 创建绝对定量(AQ)反应板文件

　　为DNA样本创建一个AQ反应板文件， 将探针添加到反应板文件中，为每个反应孔指定探针、报告基因和任务。等位基因1的报告基团为VIC，等位基因2的报告基团则为FAM。空白对照的任务选定为NTC，所有未知样品的任务则为Unknown。

　　1.3.4 执行扩增程序

　　按HT7900实时定量PCR仪器的操作说明进行。

　　1.3.5 读取扩增后荧光信号

　　为DNA样本创建一个Allelic Discrimination(等位基因鉴别)反应板文件；步骤基本同创建AQ文件。最后单击PostRead，开始读取扩增后荧光信号(图1)。

　　1.4 单体型识别和关联分析

　　1.4.1 研究样本的基本信息

　　见表1。表1 样本基本信息（略）

　　1.4.2 Haploview识别单体型

　　本研究利用Haploview识别单体型，并且我们只对达到HWE的SNP位点进行单体型识别。

　　在利用Haploview识别单体型之前，需要将分型实验所得到的基因型数据整理成Haploview所能识别的文件类型。步骤如下：

　　a)Info文件是Haploview识别单体型所需要的文件之一，记载有两列信息，第一列是SNP的id，第二列是各个SNP在染色体上的位置(图2a)。

　　b)Ped文件主要记载样本的基本信息和基因型信息(图2b)。

　　c)单体型识别：将文件载入Haploview，即可以自动生成分析结果，载入info和ped文件进行运算。

　　d)本研究中所有SNP均符合HardyWeinberg平衡。根据所选定的阈值，生成的连锁不平衡图谱如图2c所示：

　　本研究中，Haploview从CYP19的所有SNP中划分出3个单体域。生成的单体型图如图2d所示：

　　1.5 统计学分析

　　所有数据均用SPSS14.0统计软件分析。通过方差分析来研究组间标签SNP和单体型多态性关系。显著性水平α=0.01。

　　2 结 果

　　2.1 分型结果 共700例分型成功，结果见表2。表2 每个SNP的分型结果（略）注：(1)%Geno：SNP分型成功率；(2)MAF：最小等位基因频率；(3)MA：最小等位基因。

　　2.2 方差分析结果

　　见表3。表3 标签SNP位点组间基因型的方差分析结果（略）

　　结果表明，SNP rs7167343和rs8031463的不同基因型之间存在显著差异。

　　3 讨 论

　　细胞色素P450是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶，属于血红蛋白类酶，因还原型细胞色素(cytochrome， CYP)与一氧化碳的结合体在450nm处有特殊光吸收峰而得名。细胞色素P450c 19(cytochrome P450c 19， CYP19) 是细胞色素P450基因超家族成员之一，编码产物为细胞色素P450芳香化酶，人CYP19以单拷贝位于染色体15q21.1区带，全长至少75kb，由10个外显子和9个内含子组成[2]。CYP19基因有多个启动子，组织特异性表达是CYP19基因表达模式最大的特点[3]。在雄激素向雌激素的转化过程中细胞色素P450芳香化酶扮演着重要的角色，其是雌激素合成的最后一步的限速酶，局部组织芳香化酶的活性降低，可减少该组织雌激素的水平，继而引起骨质疏松。本世纪40年代ALBRIGHT等就提出骨质疏松发病与雌激素水平降低有密切关系，并认为雌激素缺乏是绝经后妇女快速丢失骨矿而导致骨质疏松的主要原因，称之为绝经后骨质疏松。女性体内雌激素主要有三种：雌酮(estrone， E1)、雌二醇(estradiol， E2)、雌三醇(estriol， E3)。青春期主要由卵巢的卵泡膜细胞颗粒细胞和黄体产生，绝经后则主要来自于肾上腺皮质分泌的雄性激素在体内的转变，雌激素水平明显下降。

　　雌激素主要通过与雌激素受体(estrogen receptor， ER)结合，作用于骨的快速丢失期，从而增加骨量及抑制绝经后骨丢失。雌激素对骨重建及维持骨量有重要意义，但确切的机制仍不清楚。机体内的治疗显示，雌激素能增强成骨型细胞的表达并减少诱导骨吸收的环磷酸腺苷的形成，还能与特异的DNA结合，促进特异mRNA合成[4]。BOBING等[5]研究了雌激素用量对绝经后骨质疏松症妇女骨矿化程度的影响，结果表明：较大剂量的雌激素可有效增加骨密度，促进骨的再矿化，有利于骨质疏松症的治疗。在校正年龄和体重指数(body mass index， BMI)后，性腺功能低下与低骨密度(bone mineral density， BMD)和高骨转换明显相关。

　　目前研究认为，雌激素缺乏及ER缺陷均有可能导致骨质疏松。雌激素缺乏包括雌激素抵抗和芳香化酶缺乏。ER存在于成骨细胞和破骨细胞的表面，MURATA等[6]发现，体内芳香化酶缺乏的男性处于睾酮水平正常状态，但雌二醇(E2)水平低下，往往伴有严重的骨质疏松症。GENNARI等[7]随访观察200例老年男性，结果发现那些游离雌激素指数、循环生物活性E2和总E2水平低于平均水平者，其股骨颈和腰椎的骨量丢失高于平均水平。通过以上研究不难发现，雌激素缺乏与骨质疏松有着极为密切的关系。

　　此外，雄激素被认为是男性骨质疏松的潜在危险因素。在青春期，雄激素主要增加骨松质及骨皮质的骨量，对骨峰值的获得起到重要作用；成年以后，雄激素主要通过促进骨形成和抑制骨吸收，并与其他骨代谢调节激素共同维持骨量和调节骨代谢。雄激素是通过调节局部的细胞因子如转化生长因子β、胰岛素样生长因子和白细胞介素6等而起作用的。离体条件下，雄激素可直接作用于破骨细胞前体及破骨细胞，可能是通过增加成骨细胞分化而调节骨代谢。目前认为，其作用方式有如下３种：①直接与雄激素受体结合，如睾酮和二氢睾酮，再刺激成骨细胞增生、分化；②雄激素在芳香酶作用下转变为二氢睾酮，再与雄激素受体结合；③雄激素经芳香酶作用转变为雌激素，再与雌激素受体(ER)结合。ER分为ERα和ERβ，大量实验证明，男性骨质疏松症与ERα有关，而与ERβ无关[8]。
　　
　　原发性骨质疏松症是多基因复杂性疾病，控制雌激素合成的基因CYP19对于研究原发性骨质疏松症是非常重要的候选基因。多数研究表明，CYP19基因多态性与男性骨质疏松有关，但相关的报道几乎均为CYP19基因(TTTA)n串联重复多态性。TTTA等位基因可能是通过与CYP19或邻近基因有功能的变异形成连锁失衡而影响芳香化酶的活性[910]。只在最近发现绝经后妇女的雌二醇水平、骨密度与CYP19基因外显子3的沉默多态性(G→A Val80)有关[11]，至于CYP19基因外显子3的沉默多态性(G→A Val80)是通过何种途径影响芳香化酶的，目前还无从推测。目前，在老年男性人群中还未见CYP19基因外显子3的沉默多态性(G→A Val80)与骨质疏松症及性激素关系的报道。总之，该领域的研究目前还太少，CYP19基因G→A多态性对男性性激素影响尚需更多更深入的研究。

　　本研究从基因水平上寻找骨质疏松症的发病机理，发现CYP19基因单体域3区内的SNP rs7167343和rs8031463与髋部骨折的发生存在较强的相关关系。因此，我们构想可以此为依据，借助基因芯片技术，在为骨质疏松症的防治提供充分理论依据的同时，及早诊断或预测骨质疏松的发生，并积极给予治疗，从而有效降低骨质疏松症及其各种相关并发症尤其是骨质疏松性骨折的发生率。

　　此外，标签SNP位点多态性以及单体域内不同的单体型对男女亚群体髋部骨折代谢的影响、多态性位点SNP rs7167343和rs8031463以及3区对其他部位骨代谢是否有影响，也是我们下一步所要研究的内容。

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