作者：胡琼花，林中，刘颖，郑清华
【摘要】 目的 探讨肠神经系统在大鼠重症急性胰腺炎肠动力紊乱时的变化以及柴芍承气汤对大鼠肠道肌间神经丛内一氧化氮合成酶(nNOS)神经元表达的影响。方法 将30只SD大鼠随机分为3组：假手术组、模型组、柴芍承气汤组(CSCQD组)；模型组和CSCQD组经胰胆管逆行注射质量浓度为50g/L的牛磺胆酸钠建立大鼠SAP模型后，分别给予生理盐水和CSCQD药液。测定大鼠的胃肠传递时间，HE染色光镜下观察胰腺的病理变化，用双重免疫荧光染色法观察回肠及结肠肌间神经丛NOS神经元的变化。结果 与模型组相比，CSCQD组传递指数(TI)明显升高(P<0.05)，胰腺组织病理损害明显减轻(P<0.05)，NOS神经元占总神经元的百分比明显降低(P<0.05)。结论 CSCQD通过逆转肠神经系统NOS神经元的可塑性变化，改善SAP大鼠的肠动力，同时减轻了胰腺的病理损伤。
【关键词】 重症急性胰腺炎；柴芍承气汤；肠神经系统；一氧化氮合成酶
ABSTRACT: Objective To investigate the changes of enteric nervous system in gastrointestinal motility disorder in rats with severe acute pancreatitis (SAP) as well as the influence of Chaishao Chengqi Decoction on neuronal nitric oxide synthase neuron (nNOS) neuron expression in myenteric plexus of rat intestinal tract. Methods SD rats were randomly pided into 3 groups (10 for each): sham operation group， model group and Chaishao Chengqi Decoction (CSCQD) group. SAP model was established in model group and CSCQD group rats by retrograde injection of 50g/L sodium taurocholate into the junction of the common bile duct and pancreatic duct. Model group was administered with normal saline and CSCQD group was administered with Chaishao Chengqi Decoction. The gastrointestinal transmission time was observed. Pathological changes of the pancreas were examined with HE staining under light microscope. The neuronal nitric oxide synthase neurons in the small intestines and colonic myenteric plexus were detected by the dual immunofluorescent staining. Results Compared with that in model group， transmission index was increased in CSCQD group (P<0.05). The pathological lesion of the pancreas in CSCQD group was significantly lessened (P<0.05). The percentage of NOSimmunoreactive neurons was significantly decreased (P<0.05). Conclusion By reversing the plasticity of NOSimmunoreactive neurons， Chaishao Chengqi Decoction improves the gastrointestinal motility in rats with SAP and reduces the pathological damages of the pancreas.
KEY WORDS: severe acute pancreatitis; Chaishao Chengqi Decoction; enteric nervous system; nitric oxide synthase
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis， SAP)是一种严重威胁人类生命的疾病，其病死率高达0.163[1]。近年发现胃、肠是最易受损的器官之一。肠动力的改变在SAP整个发病和预后中起重要作用，尽早恢复肠运动功能是阻止SAP病程危重演变的关键。临床上对SAP患者多采用西医结合">中西医结合综合治疗。大量研究已证实，具有通里攻下作用的中药方剂柴芍承气汤(chaishao chengqi decoction， CSCQD)能加速肠道功能恢复，减轻症状，降低并发症的发生率和该病的病死率[24]。本实验在大鼠SAP模型基础上，通过观察CSCQD对肠神经系统(enteric nervous system， ENS)一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase， NOS)神经元的影响，初步探究CSCQD在改善SAP肠动力方面可能的机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级SD大鼠30只，雄性，体重200～250g，购自桂林医学院实验动物中心。
1.2 药物及试剂
牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司；CSCQD：柴胡10g、白芍10g、黄芩10g、厚朴10g、枳实10g、生大黄10g(后下)、芒硝10g(另冲)，由桂林医学院附属医院制剂室配制，质量浓度为1g/mL，灭菌处理后瓶装于4℃保存；AntiHuman Neuronal Protein HuC/HuD(antiHuC/HuD)购自美国Molecular Probes公司；NOS1(R20)购自美国Santa Cruz公司；TRITC标记山羊抗兔IgG(H+L)、FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 仪器 解剖显微镜Stemi 2000CS，SIP NO.MIC 00945系蔡司光学仪器(上海)国际贸易有限公司产品；OLYMPUS正置荧光显微镜系日本奥林巴斯仪器公司产品。
1.4 方法
1.4.1 SAP模型的建立
造模前大鼠禁食24h，可自由饮水，质量浓度为250g/L乌拉坦4mL/kg腹腔内注射麻醉，开腹，辨认胰胆管及十二指肠乳头开口处；在肠系膜对侧肠壁上选一无血管区，用四号半针头经十二指肠乳头开口处探入胰胆管，顺其走向推进4～5mm后，用动脉夹夹住胰胆管开口及近肝门部胆管，接微量泵逆行泵入质量浓度50g/L牛磺胆酸钠(1mL/kg，0.1mL/min)；2～3min后即可见胰腺充血、水肿、胰胆管扩张，维持8～10min后，松开动脉夹，拔针，将肠管复位，分层关腹；术后皮下补液(生理盐水10mL)。
1.4.2 分组及给药方法
将30只SD大鼠随机分为3组：假手术组(10只)开腹翻动十二指肠及胰腺后关腹，皮下补生理盐水10mL；术后1、2、3h，按1mL/100g经胃管灌服生理盐水；模型组(10只)制作SAP模型后1、2、3h按1mL/100g经胃管灌服生理盐水；CSCQD组制作SAP模型后1、2、3h按1mL/100g经胃管灌服柴芍承气汤。
1.4.3 测定胃肠传递时间
3组大鼠术后24h灌服质量浓度10g/L台盼蓝1.5mL，30min后开腹，测定胃肠传递时间，用传递指数(TI)表示。台盼蓝被推进的长度(从幽门计起)与小肠全长之比，即为TI。
1.4.4 标本的采集
3组大鼠观察腹腔内腹水情况、皂化情况及胰腺的大体改变；切取胰腺放入福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片，苏木素伊红(HE)染色，光镜下观察病理变化。光镜下，胰腺病理组织评分按组织水肿、炎性细胞浸润、出血、坏死程度不同分为0～4分，由同一病理医师单盲检查评分。
1.4.5 制作回、结肠肌间神经丛全层标本
3组大鼠辨认回盲部，取距回盲部3cm的长约1.5cm的回肠和结肠，于冰的Kreb液中漂洗干净后，沿肠系膜剪开肠管，浆膜面朝上固定在木板上，用Stefanini液4℃固定24h；将浆膜、纵行肌连同肌间神经丛一同剥下，在解剖显微镜下剔除附着的环形肌，即制成全层标本。
1.4.6 双重免疫荧光染色
将制备好的回、结肠全层标本用含体积分数为50mL/LTritonX 100、体积分数为100mL/L的正常山羊封闭血清的PBS 22℃孵育30～60min；antiHuC/HuD(质量浓度为10g/L)4℃孵育24h；NOS1(R20)(1∶100)4℃孵育24h；FITC标记山羊抗小鼠IgG(1∶100)22℃孵育45min；TRITC标记山羊抗兔IgG(1∶200)22℃孵育45min；甘油封片。每一道程序后均用PBS洗涤3次，每次10min。
1.4.7 染色结果的判断
用Hu蛋白为神经元标志物显示所有神经元，用NOS1(R20)显示其阳性神经元；用TRITC(红)、FITC(绿)标记的二抗显示不同的一抗；用荧光显微镜观察计算每200个神经元中NOS神经元所占比例。
1.4.8 统计学方法
采用SPSS17.0统计分析软件对计量资料进行统计分析，数据用均数±标准差(±s)表示，采用方差分析及LSD及Duncan检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肠道台盼蓝TI的测定
与假手术组相比，模型组的TI明显降低[(0.38±0.0179) vs. (0.23±0.0156)，P<0.05]，CSCQD组与模型组相比，TI明显升高[(0.51±0.0145) vs. (0.23±0.0156)，P<0.05]。
2.2 病理形态学的改变
2.2.1 大体形态的观察
假手术组腹腔内基本无腹水，未见异常改变。模型组腹腔内有大量红色或暗红色浑浊腹水，肠管明显肿胀，肠系膜、大网膜及胰腺周围可见脂肪皂化；胰腺明显肿大、变硬、灶性坏死。CSCQD组腹腔内仅见少量淡红色渗出液，肠管肿胀减轻，肠系膜、大网膜偶见散在的脂肪皂化，胰腺肿胀、坏死程度较模型组减轻。
2.2.2 光镜下胰腺结构的观察
假手术组胰腺结构正常，小叶结构存在，腺泡完整，间质清晰，基本无充血、炎性细胞浸润。模型组胰腺片状出血、坏死，腺叶结构破坏，腺泡欠完整，间质显著增宽，充血、水肿，大量中性粒细胞及单核细胞等炎性细胞浸润。CSCQD组胰腺组织病理改变较模型组明显减轻，病理学评分较模型组显著改善(图1、表1)。表1 3组大鼠胰腺病理评分及NOS神经元所占比例（略）
2.3 大鼠回、结肠全层标本的染色情况
荧光显微镜下，大鼠回、结肠主要由神经节和神经纤维构成。全层标本经antiHuC/HuD染色后观察，神经元胞体形态多样，呈卵圆形、三角形及不规则形；胞浆、胞核均染为绿色，神经纤维不着色。全层标本经NOS1(R20)染色后观察，神经元胞体大小不等，形态多样；胞质呈红色，胞核不着色，神经纤维着色呈网格状分布。模型组与假手术组相比，NOS神经元胞体体积增大且着色较深，神经纤维粗大；NOS神经元所占比例明显增加(P<0.05)。CSCQD组介于两组之间(图2、表1)。
3 讨 论
SAP是临床上常见的急危重症之一，病情凶险，病死率高。在SAP发病过程中早期出现的胃肠动力改变是引起SAP后继发感染[56]，诱发全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome， SIRS)，多器官功能障碍的关键环节之一[78]。在大承气汤(大黄、厚朴、枳实、芒硝)基础上加柴胡、白芍、黄芩组成的CSCQD是多年来经证实的在促进肠道功能恢复、减轻胰腺损伤等方面具有积极作用的中药方剂。本实验通过检测CSCQD对SAP大鼠肠动力的影响并观察肠神经系统NOS阳性神经元的变化，探讨其在促进肠动力方面可能的作用机制。
有“微型脑”[9]之称的ENS是控制胃肠运动的一个独立的整合系统，SAP时出现的小肠移行性运动复合波(migrating motor complex， MMC)周期延长就与其有关。ENS主要由肌间神经丛和黏膜下神经丛构成，凭介其所分泌的抑制性和兴奋性神经递质之间的平衡，维持胃肠道正常的蠕动。NOS神经元是来自ENS的主要的抑制性神经元[10]，其分泌的NO在松弛胃肠道平滑肌方面具有重要的作用，但因其半衰期短，性质不稳定，故多通过对NOS活性的研究，间接判断NO的变化。
ENS神经元拥有重塑的特性，在其受到损伤、靶器官受到损害或体内内环境发生改变的情况下，会产生适应性变化，包括神经元数目的增减、神经递质表达的上调、下调及重新获得合成某些神经递质的功能[1114]。近年来，一些国内外学者对ENS神经元在AP肠动力紊乱时的变化进行了研究：MASCOLO等[15]认为胰腺炎麻痹性肠梗阻的发生可能与激活胆碱能神经元和(或)SP阳性神经元CB1受体，引起兴奋性神经递质Ach和(或)SP释放减少有关。刘殿刚等[16]发现SAP腹水组大鼠小肠肌间神经丛和黏膜下神经丛NOS表达增强，应用NOS抑制剂LNAME后可提高小肠运动的频率并抑制胰腺炎相关腹水对肠管运动及电活动的影响；从而推测SAP相关腹水可使NOS表达上调，NO生成增多，小肠平滑肌电生理紊乱，胃肠运动障碍。
Hu蛋白是一种神经元标志物，仅表达在神经元的胞体及胞核，故能清晰的显示回、结肠wholemount中各种类型的神经元；NOS表达在其阳性神经元的胞体。本实验胰腺病理学改变和台盼蓝TI结果证实，我们所建立的大鼠SAP模型存在肠动力减退。在此基础上，利用双重免疫荧光染色法观察回、结肠wholemount NOS神经元的形态及比例改变，结果发现模型组大鼠回、结肠肌间神经丛NOS阳性神经元与假手术组相比，所占比例明显增加(P<0.05)且胞体大而染色深，说明大鼠SAP时ENS重塑，NOS神经元功能异常，肠道主要的抑制性神经递质NO生成增多，发挥抑制性的功能增强，肠动力障碍。已有研究发现SAP患者血清NO水平升高[17]，血清中的NO部分来源于ENS，结合本实验结果，推测血清NO水平升高与ENS重塑有关。
CSCQD具有通里攻下、清热解毒的功效，其成分有柴胡、白芍、黄芩、枳实、厚朴、生大黄、芒硝。柴胡、枳实促进胃排空；柴胡、枳实、厚朴、芒硝增加小肠蠕动；生大黄促进结肠蠕动[18]，和芒硝配伍后能增加胃肠蠕动，促进肠内容物的排空[19]。除了促进胃肠道动力，该方剂中的生大黄能改善胰腺缺血及微循环；黄苓能抑制细菌，防止内毒素诱发DIC[20]；厚朴能广谱抗菌；柴胡能抗菌、利胆；白芍能解痉、镇痛。总之，CSCQD能减轻SAP时各脏器的病理学变化，作用于SAP的多个环节。
近年来，许多学者经动物实验及临床观察已证实CSCQD利用其多靶点作用、系统性综合治疗的优势，治疗SAP取得了满意疗效。黄旻等[21]发现CSCQD能减轻SAP大鼠胰腺及肠道组织的病理损害，抑制肠黏膜上皮细胞的凋亡，增加肠绒毛高度及黏膜厚度，保护肠黏膜屏障。该方剂还可通过降低机体的过度炎症反应即降低SAP时血清C反应蛋白、白介素6和肿瘤坏死因子α的含量来治疗SAP[22]。CSCQD在治疗SAP引起的肠动力紊乱方面，也已取得一些进展。寇学斌[23]认为CSCQD通过增加SAP时胃动素(MTL)的浓度，促进肠动力恢复，保护肠黏膜屏障，减少细菌及内毒素移位。肖桂林等[24]发现CSCQD中的大黄、黄芩等成分可抑制内源性NO的生物合成与释放，恢复肠道平滑肌的正常运动功能。许多临床研究发现CSCQD能使重症急性胰腺炎患者腹痛、腹胀缓解时间，肠鸣音恢复时间明显缩短[2526]。本实验胰腺病理学改变和台盼蓝TI结果提示，CSCQD能减轻SAP大鼠胰腺病理损害，同时能改善肠动力，促进肠内容物排出，降低肠管扩张程度；根据双重免疫荧光染色结果可以推测CSCQD促进小肠及结肠动力的恢复与降低回、结肠肌间神经丛NOS阳性神经元所占比例，逆转该神经元的可塑性变化等均与肠道平滑肌收缩有关。
CSCQD具有价格便宜、毒副作用少等优点。该中药在SAP治疗中的介入，显示出较好的疗效。但是，其作用机制尚不明确，其作用靶点和具体有效成分尚待进一步研究。
参考文献
[1]FU CY， YEH CN， HSU JT， et al. Timing of mortality in severe acute pancreatitis experience from 643 patients [J]. World J Gastroenterol， 2007， 13(13):19661969.
[2]黄平，张啸. 冰片及芒硝外敷联合柴芍承气汤内服对重症急性胰腺炎并发肠麻痹的疗效观察 [J]. 中国中西医结合消化杂志， 2009， 17(2):105108.
[3]韦善学. 中西医结合治疗重症急性胰腺炎34例的疗效观察 [J]. 广西医学， 2009， 31(4):547549.
[4]彭燕，王忠群，李云，等. 柴芍承气汤对重症急性胰腺炎并发肠麻痹的治疗作用 [J]. 四川医学， 2003， 24(6):571572.
[5]SAWA H， UEDA T， TAKEYAMA Y， et al. Treatment outcome of selective digestive decontamination and enteral nutrition in patients with severe acute pancreatitis [J]. J Hepatobiliary Pancreat Surg， 2007， 14(5):503508.
[6]KEDARI A， WIG JD， VAIPHEI K， et al. Histopathological sequential changes in sodium taurocholateinduced acute pancreatitis [J]. JOP， 2007， 8(5):564572.
[7]MINNEN LV， BLOM M， TIMMERMAN HM， et al. The use of animal models to study bacterial translocation during acute pancreatitis [J]. J Gastrointest Surg， 2007， 11(5):682689.
[8]ZHAO H， LU HG， SHI YB， et al. Role of enteral nutrition supplemented with ebselen and EHEC in pancreatitisassociated multiple organ dysfunction in rats [J]. Inflamm Res， 2006， 55(10):423429.
[9]WEDEL T， BOTTNE M， KRAMMER HJ. The enteric nervous system and interstitial cells of Cajal changes in chronic constipation in adults [J]. Pathology， 2007， 28(2):143148.
[10]李玉梅，陆国明. 应激对大鼠结肠神经系统nNOS表达的影响 [J]. 世界华人消化杂志， 2005， 13(23):27662769.
[11]EKELUND K，EKBLAD E. Structural neuronal and functional adaptive changes in atrophic rat ileum [J]. Gut， 1999， 45(2):236245.
[12]LIN Z， SANDGREN K， EKBLAD E. Increased expression of nitric oxide synthase in cultured neurons from adult rat colonic submucous ganglia [J]. Auton Neurosci， 2004， 114(1):2938.
[13]LIN Z， SANDGREN K， EKBBAD E. Increased expression of vasoactive intestinal polypeptide in cultured myenteric neurons from adult rat small intestine [J]. Auton Neurosci， 2003， 107(1):919.
[14]林中，张剑波，赵永忠，等. 小肠肌间神经丛神经元体外培养抑制肠平滑肌细胞的增殖 [J]. 世界华人消化杂志， 2008， 16(14):15771580.
[15]MASCOLO N， IZZO A， LIGRESTI A， et al. The endocannabinoid system and the molecular basis of paralytic ileus in mice [J]. FASEB J， 2002， 16(14):19731975.
[16]刘殿刚，孙家邦，张淑文，等. 胰腺炎相关腹水对空肠运动和肠组织含nNOS神经的影响 [J]. 首都医科大学学报， 2005， 26(4):482485.
[17]METTU SR， WIG JD， KBULLAR M， et al. Efficacy of serum nitric oxide level estimation in assessing the severity of necrotizing pancreatitis [J]. Pancrentelogy， 2003， 3(6):506514.
[18]陈德昌，景炳文，杨兴易. 大黄对胃肠功能衰竭的治疗作用 [J]. 解放军医学杂志， 1996， 21(1):2426.
[19]吴承堂，黄祥成，齐德林，等. 急性坏死性胰腺炎早期内毒素血症及其防治 [J]. 第一军医大学学报， 1999， 19(5)402404.
[20]巫协宁. 重症胰腺炎治疗的实验和临床研究 [J]. 胃肠病学和肝病学杂志， 2001， 10(1):35.
[21]黄旻，吴小翎. 柴芍承气汤对大鼠重症胰腺炎肠道屏障功能的影响 [J]. 疑难病杂志， 2008， 7(10):588590.
[22]罗玉明，赵海明. 柴芍承气汤治疗急性重症胰腺炎大鼠的实验研究 [J]. 中国中医基础医学杂志， 2009， 15(1):4648.
[23]寇学斌. 柴芍承气汤治疗重症急性胰腺炎合并急性肠功能衰竭疗效观察 [J]. 中国医药， 2007， 2(7):402404.
[24]肖桂林，刘发益，金益强. 大黄煎剂对多发伤并严重感染患者中内毒素、白细胞介素6和一氧化氮的影响 [J]. 中华创伤杂志， 2002， 18(8):482484.
[25]王黎明，罗 华，王懿娜，等. 中西医结合治疗急性重症胰腺炎28例 [J]. 世界华人消化杂志， 2007， 15(25):27472749.
[26]黄平，张啸. 冰片及芒硝外敷联合柴芍承气汤内服对重症急性胰腺炎并发肠麻痹的疗效观察 [J]. 中国中西医结合消化杂志， 2009， 17(2):105108.