实验性肝硬化大鼠细胞因子IL18、TNFα、IFNγ的变化及意义

　　　　作者：党双锁，高宁，程延安，边静，王顺达，孙明珠

【摘要】 　　目的 探讨在四氯化碳(CCl4) 复合因素诱导实验性肝硬化大鼠的形成过程中，白介素18(IL18)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、γ干扰素(IFNγ)的变化及意义。方法 将80只清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照组和造模2周组、4周组、6周组，每组20只。予以CCl4复合因素诱导大鼠肝硬化，并在2、4、6周3个时间点分别处死6只大鼠。采用ELISA法检测大鼠血清IL18、TNFα、IFNγ和肝脏组织匀浆上清液中的IL18含量；HE染色观察肝脏的组织病理学变化。结果 ①CCl4复合因素诱导的实验性大鼠，组织病理学观察发现，2周时大鼠肝脏组织细胞肿胀变性，6周时有大量纤维增生，部分肝组织有假小叶的形成；②随着造模时间的延长，实验大鼠血清IL18、TNFα、IFNγ水平逐渐升高，造模6周组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；③造模组肝脏组织匀浆中IL18随肝损害程度的加重而升高，造模6周组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 在CCl4复合因素诱导大鼠肝硬化的形成过程中，IL18、TNFα、IFNγ水平逐渐升高，提示该3种细胞因子与肝硬化的形成及发展有关。

【关键词】 大鼠；肝硬化；白介素18；肿瘤坏死因子α；γ干扰素

　　ABSTRACT: Objective To investigate the changes of interleukin18 (IL18)， tumor necrosis factorα(TNFα) and interferonγ (IFNγ) levels of liver cirrhosis induced by the composite factors of carbon tetrachloride (CCl4) in SD rats and their significance. Methods Totally 80 male SD rats of clean class were randomly pided into normal control group (20 rats) and model groups， the latter of which were further pided into three groups according to the length of administration time， namely， 2week group (2 wk group)， 4week group (4 wk group) and 6week group (6 wk group)， with 20 rats in each. Six rats were killed after 2 wk， 4 wk and 6 wk administration time， respectively. The rat serum levels of IL18， TNFα and IFNγ and the hepatic homogenate supernatant of IL18 were detected by ELISA; pathological changes of liver tissues were observed by HE staining. Results ① Pathological observation revealed that in the model groups hepatic cells degenerated and swelled at week 2 while large amounts of fibrosis and pseudolobules of some liver tissues occurred at week 6. ② The serum levels of IL18， TNFα and IFNγ were gradually increased with the modeling time， and they were significantly higher in 6week group than in normal control group (P<0.01). ③ The levels of hepatic homogenate supernatant of IL18 in the model groups were elevated with liver damage， and they were significantly higher in 6week group than in normal control group (P<0.01). Conclusion During the formation of liver cirrhosis induced by composite factors of CCl4 in rats， IL18， TNFα and IFNγ levels gradually increase， suggesting that the three cytokines play a certain role during the occurrence of liver cirrhosis in rats.

　　KEY WORDS: rat; liver cirrhosis; interleukin18; tumor necrosis factor (TNFα); interferonγ (IFNγ)

　　肝硬化是慢性肝损伤所共有的终末病理改变。在肝硬化的形成中，有大量细胞因子通过参与调节组织细胞的损伤修复过程而发挥作用[1]。新近发现，白介素18(interleukin18， IL18)是新的致炎因子。研究发现，IL18参与了免疫调控，其过度表达可能引起免疫系统紊乱和组织器官的免疫炎性损害。本研究通过建立四氯化碳(CCl4)复合因素诱导的大鼠肝硬化模型，动态检测造模组大鼠IL18及相关细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)、γ干扰素(IFNγ)水平的变化，初步探讨细胞因子在肝硬化形成中的作用及意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器

　　CCl4(分析纯)购自西安化学试剂厂；橄榄油(化学纯)、胆固醇(分析纯)购自上海化学试剂公司；大鼠IL18定量ELISA试剂盒为美国Biosource公司生产，上海森雄科技有限公司进口分装；大鼠TNFα、IFNγ定量ELISA试剂盒购自上海西唐生物有限公司；RIPA裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；DG3021型酶联免疫检测仪为华东电子管厂产品。

　　1.2 实验动物与分组

　　清洁级雄性SD大鼠80只，3～4个月龄，体重360～380g，平均(367±14.12)g，购于西安交通大学医学院实验动物中心。据肝硬化造模时间长短将SD大鼠随机分成4组：正常对照组、造模2周组、造模4周组、造模6周组，每组20只。所有大鼠分笼饲养于西安交通大学医学院实验动物房。正常对照组，自由取食且不做任何处理；造模2、4、6周组，每周2次皮下注射400mL/L CCl4橄榄油溶液3mL/kg，首次剂量为5mL/kg；同时给予高脂饲料(80%单纯玉米粉+20%猪油+0.5%胆固醇)作为唯一饮食，并以300mL/L乙醇作为饮水饲养动物。每周一、四注射，且注射前称体重。于造摸2、4、6周时各组分别随机选取动物6只，水合氯醛腹腔内麻醉，腹主动脉插管取血，并留取肝脏做组织匀浆及40g/L甲醛溶液固定，常规石蜡切片，HE染色。

　　1.3 方法

　　1.3.1 ELISA法测定血清IL18、TNFα、IFNγ水平

　　血液3000r/min离心20min，吸取血清，采用双抗体夹心ELISA法测定，严格按照说明书操作。

　　1.3.2 ELISA法测定肝组织匀浆中IL18水平

　　取大鼠部分肝脏组织，冰冷等渗盐水漂洗数次后，除去血液，滤纸吸干，称取1g肝组织，用手动匀浆器将肝组织在磷酸盐缓冲溶液(PBS)和0.1mmol/L苯甲基磺酰氟化物(PMSF)中充分研磨匀浆，100000r/min 4℃离心15min，取上清液，采用双抗体夹心ELISA法测定，严格按照说明书操作。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS 13.0统计软件处理。计量资料数据以±s表示，进行单因素方差分析，各组间比较采用LSDt检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠肝脏的组织病理学改变

　　正常大鼠肝组织细胞大小一致，细胞排列呈条索状，以中央静脉为中心呈放射状，肝窦无狭窄，小叶及汇管区无炎细胞浸润(图1A)。CCl4复合因素诱导2周后，大鼠肝脏充血、肿胀，包膜紧张，镜下肝细胞肿胀，呈气球样变，以汇管区周围较明显(图1B)；4周后大鼠肝脏充血、肿胀进一步加重，镜下见大面积肝细胞变性和坏死，坏死以小叶周围显著，汇管区少量炎症细胞浸润及纤维组织增生(图1C)；6周后大鼠肝脏充血、肿胀消退，肝脏轻度萎缩，镜下汇管区纤维增生，并向小叶内伸展，见不完整假小叶形成(图1D)。

　　2.2 大鼠血清IL18、TNFα、IFNγ水平的动态变化

　　与正常对照组相比，造模2周组大鼠血清IL18、TNFα的差异有统计学意义(P<0.01)，而IFNγ差异无统计学意义(P>0.05)；4周、6周造模组大鼠血清IL18、TNFα、IFNγ明显增高，与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。各造模组间比较，6周组IL18、TNFα、IFNγ水平较2、4周组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01，表1)。表1 各组大鼠血清IL18、TNFα、IFNγ水平的比较（略）

　　2.3 大鼠肝组织匀浆中IL18水平的变化

　　与正常对照组相比，4、6周造模组大鼠肝组织匀浆中IL18增高，差异有统计学意义(P<0.01)，且6周组肝组织匀浆中IL18较2、4周组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01，表2)。表2 各组大鼠肝组织匀浆中IL18水平的比较（略）

　　3 讨 论

　　1995年OKAMURA等[2对感染疮疱棒状杆菌(P.acnes)的小鼠肝脏提取物用脂多糖(LPS)加强刺激，可诱导出使IFNγ高水平表达的因子，最初把该因子称作IFNγ诱导因子(IGIF)。进一步研究发现，这是一种新的炎性细胞因子，有亲多种组织的免疫活性，命名为白介素18[3]。目前研究发现，IL18是由活化的巨噬细胞产生的一种强有力的免疫调节细胞因子，具有多种生物学活性：诱导Th1细胞、NK细胞等多种免疫细胞产生IFNγ、TNFα、Fas配体及穿孔素；促进T细胞增殖[4]；增强FasL介导的Th1细胞、自然杀伤细胞(NK)的细胞毒活性作用，导致肝实质细胞的免疫性损伤[5]。
　　
　　本研究结果表明，在CCl4复合因素诱导大鼠肝硬化形成的6周中，血清细胞因子IL18、TNFα、IFNγ水平均高于正常对照组；同时在诱导的不同时间点收集大鼠肝脏组织，测定肝组织匀浆中IL18的含量，结果发现随着肝硬化程度的加重IL18含量逐渐升高。提示IL18参与了肝脏炎症、肝硬化的发生发展过程，且IL18、IFNγ、TNFα等细胞因子呈网络调控，相互诱生，共同发挥作用。国外学者研究报道，在原发性胆汁性肝硬化时，体内炎症因子(TNFα、IL6、IL8等)也同样升高，并认为其在原发性胆汁性肝硬化的形成中起重要作用[68]。也有学者报道，酒精性肝硬化的形成是由于致炎因子与抗炎因子(IL2、IL10、TGFβ等)相互制衡失调而发生的。我们的研究结果也证实，在CCl4复合因素引起的肝硬化形成中，IL18、IFNγ、TNFα发挥了协同作用。至于其作用机制，结合现有学者的研究结果分析，可能是细胞因子之间通过自分泌或旁分泌机制的网络调节而致肝硬化的形成[9]：①IL18可通过诱生IFNγ和其他细胞因子(IL2、GMCSF、TNFα等)的产生而形成IL18/Th1细胞因子组成的细胞因子级联而发挥作用[10]；②作为炎性细胞因子的IL18还可刺激免疫细胞(Th1细胞、NK细胞等)释放更多的细胞因子，如IFNγ、TNFα等，形成正反馈的放大作用，产生更多的ECM，从而导致肝纤维化乃致肝硬化的形成[11]。
　　
　　愈来愈多的研究表明，IL18作为一种重要的前炎症因子，在感染、肿瘤等多种疾病中发挥作用[1216]。本研究也证实了IL18在肝损伤到肝硬化的形成过程中的作用。因此，测定IL18不仅可作为临床判断病情进展的一项有益指标，同时也可作为治疗靶点为治疗肝硬化提供新的途径。相信随着对IL18及其他细胞因子认识的进一步深入，将为阐释肝脏疾病的发生机制及防治提供更加有意义的依据。

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