谷氨酸受体6在海人藻酸致痫大鼠发病机制中的作用

　　　　 作者：刘晓梅，孙伟，李小翠，孙亚峰，汤仁仙，裴冬生，张光毅

【摘要】 　　目的 研究谷氨酸受体6(GluR6)在癫痫发病中的分子机制。方法 采用海人藻酸(KA)腹腔注射SD大鼠，用免疫沉淀、免疫印迹的方法检测在KA注射后不同时间点海马CA3区GluR6·PSD95·MLK3信号模块的组装。同时使用免疫组化和免疫印迹的方法观察小肽TatGluR69c对MLK3磷酸化水平的影响。结果 KA诱导了大鼠海马CA3区GluR6·PSD95·MLK3信号模块的组装，在KA刺激6h和12h达到结合高峰，1d后开始降低；而TatGluR69c抑制了KA注射6h MLK3的激活(P<0.05)。结论 KA受体GluR6通过GluR6·PSD95·MLK3信号模块，激活了MLK3，参与了KA诱导的脑损伤。

【关键词】 海人藻酸；癫痫；谷氨酸受体6；MLK3

　　ABSTRACT: Objective To study the molecular mechanism of glutamate receptor6 (GluR6) in the pathogenesis of epilepsy. Methods Seizure model of SD rats was induced by intraperitoneal injection of kainate (KA). Immunoprecipitation and immunoblotting were performed to examine the interactions of GluR6 and MLK3 with PSD95 at various time points after KA injection. The effect of TatGluR69c on the MLK3 phospharylation induced by kainate was observed with immunoblotting and immunohistochemistry. Results The assembly of GluR6 and MLK3 with PSD95 was induced after KA injection in the model group， reached the peak level at 6h and 12h in hippocampal CA3 region， and bagan to decrease one day later. Pretreatment with TatGluR69c significantly inhibited the activation of MLK3 at 6h after KA injection in CA3 region (P<0.05). Conclusion KA induces the assembly of the GluR6PSD95MLK3 signaling module and subsequently activates MLK3， which ultimately results in brain injury.

　　KEY WORDS: kainate; epilepsy; glutamate receptor6 (GluR6); MLK3

　　海人藻酸(KA)为KA受体和AMPA受体外源性的激动剂，对KA受体具有高选择性。大鼠或小鼠注射KA可诱发癫痫并伴随边缘系统神经元，特别是海马锥体神经元的损伤。基于病理学和行为学上的相似性，KA所致啮齿动物的癫痫发作已被公认为研究人类癫痫的理想动物模型。GluR6作为KA受体的亚基之一，在癫痫发病机制中的作用仍不是十分清楚。研究发现，GluR6缺陷鼠可以拮抗KA诱导的癫痫及对神经元的毒性作用[1]，GluR6羧基端可与突触后密集区(postsynaptic density， PSD)的锚定蛋白PSD95的PDZ1结构域结合[2]，而MAPKKK家族的MLK3又可以与PSD95的SH3结构域相结合[3]。那么，KA能否诱导并增强GluR6·PSD95·MLK3信号模块在癫痫发作过程中的组装？本研究对KA致痫大鼠在海马CA3区不同时间点GluR6·PSD95·MLK3信号模块的组装进行动态观察，并用TatGluR69c(含有GluR6羧基末端的9个氨基酸的融合肽)干预其对MLK3磷酸化水平的影响，探讨GluR6在癫痫发病分子机制中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　雄性SD大鼠，体重210～250g，清洁度Ⅱ级，由徐州医学院实验动物中心提供。将大鼠随机分为生理盐水(saline)组、KA致痫组、TatGluR69c组、TatGluR6AA组，其中KA致痫组又根据KA注射后3、6、12h、1、3d各时间点分为5个亚组。每组及每亚组各6只大鼠。

　　1.2 主要试剂

　　KA购自Biomol公司；TatGluR69c (TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArgArgLeuProGlyLysGluThrMetAla)和对照肽TatGluR6AA(TyrGlyArgLysLys ArgArgGlnArgArgArgArgLeuProGlyLysAlaAlaAspAsp)由西安美联生物科技有限公司合成；兔抗pMLK3多克隆抗体购自Cell Signaling公司；羊抗GluR6、兔抗MLK3抗体购自Santa Cruz公司；鼠抗PSD95单克隆抗体、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG购自SigmaAldrich公司；免疫组化试剂购自北京中山生物技术公司。

　　1.3 SD大鼠癫痫模型的建立

　　溶于生理盐水的KA按12mg/kg腹腔注射(i.p.)SD大鼠，注射体积为3.2mL/kg，对照组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。参考Racine制定的分级法[4]，将大鼠癫痫行为分为6级。Ⅰ级面部阵挛包括凝视、动须、节律性咀嚼、偶尔湿狗样颤动；Ⅱ级节律性点头、湿狗样颤动；Ⅲ级前肢痉挛；Ⅳ级后肢站立、全身强直性惊厥；Ⅴ级后肢站立伴摔倒、奔跑等；Ⅵ级癫痫导致大鼠死亡。大鼠有3次以上Ⅳ～Ⅴ级发作，即被认为模型成功。

　　1.4 脑室注射给药

　　TatGluR69c和TatGluR6AA分别以10g/L的浓度、体积10μL，在KA注射前40min行侧脑室注射；注射同体积的生理盐水作为阴性对照。位置为：从前囟后开0.8mm，旁开1.5mm，深3.5mm。

　　1.5 样品的制备

　　取双侧海马，将其CA3区分离出来，匀浆，800g×15min于4℃离心，移取上清液，置-80℃冰箱待用。

　　1.6 蛋白浓度的测定

　　采用改良Lowrys法，以牛血清白蛋白(BSA， fraction Ⅴ)为标准蛋白。

　　1.7 免疫沉淀与免疫印迹

　　等量蛋白样品以蛋白A/G琼脂糖(protein A/Gsepharose)预吸附1h ，10000g×2min，4℃离心；取上清，加入抗体，旋转混匀器上4℃反应，过夜，再加入protein A/Gsepharose，旋转混匀器上4℃反应2h，10000g×2min，4℃离心；取沉淀，用免疫沉淀(immunoprecipitation， IP)缓冲液洗3遍，加入等体积蛋白上样缓冲液，混匀后置沸水浴中5min以洗脱琼脂糖上结合的蛋白，10000g×2min，吸取上清液用于免疫印迹(immunoblotting， IB)。蛋白样品经SDSPAGE，湿转至NC膜，室温封闭3h后加入一抗，4℃过夜，取出，洗膜3次，然后加入二抗，室温2h，洗膜3次，NBT/BCIP显色。

　　1.8 免疫组化

　　取海马切片进行免疫组化检测[5]，以PBS取代一抗和二抗作为空白对照。

　　1.9 统计学方法

　　采用SPSS12.0软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间差异用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 行为学的表现

　　大鼠在KA注射30min内出现凝视、偶尔湿狗样颤动，而后间隔2～3min，节律性点头、湿狗样颤动。平均潜伏期(80±10)min后，分级达到Ⅳ～Ⅴ级。TatGluR69c干预组大鼠2h 内基本无癫痫发作，而后仅有Ⅱ级～Ⅲ级轻微发作。

　　2.2 KA诱导并增强了大鼠海马CA3区GluR6·PSD95·MLK3信号模块的组装 免疫印迹结果显示：在KA刺激3h，海马CA3区可见GluR6·PSD95·MLK3之间的相互结合出现极明显的升高；6h和12h达到结合高峰，1d后开始降低(图1)。生理盐水对照组在时间曲线中对GluR6·PSD95·MLK3之间的相互结合无明显影响。

　　2.3 KA诱导了大鼠海马CA3区MLK3的激活

　　如图2所示，MLK3的磷酸化水平在KA注射6h和1d出现两次高峰；而MLK3的蛋白表达并无显著改变。提示在KA诱导的大鼠癫痫持续状态中，MLK3可以通过GluR6、PSD95而被激活。

　　2.4 TatGluR69c抑制了KA诱导的海马CA3区MLK3的激活

　　TatGluR69c阻断了GluR6与PSD95的结合，抑制了GluR6·PSD95·MLK3信号模块的组装，从而抑制了KA注射6h MLK3的激活，与KA注射组比较具有明显差异(P<0.05)；而相同剂量的对照肽TatGluR6AA对KA注射6h MLK3的磷酸化水平并没有显著影响(图3)。免疫组化与免疫印迹的结果完全一致(图4)。

　　3 讨 论

　　谷氨酸(Glu)是中枢神经系统内重要的兴奋性神经递质，一直被认为与癫痫的发作密切相关。谷氨酸门控三种离子型的受体：NMDA受体、AMPA受体和KA受体。其中KA受体又由GluR5、6、7和KA12五种亚基组成。在大鼠脑缺血模型中已证实PSD95/SAP90一方面通过PDZ1结构域与GluR6羧基端RLPGKETMA序列结合，另一方面又通过SH3结构域与MLK3结合，形成GluR6·PSD95·MLK3三元复合物，最终介导了海马CA1区神经元的损伤[6]。但是，GluR6介导的由KA诱导产生的凋亡信号机制却并不十分清楚。本研究结果显示，KA诱导了大鼠癫痫发作，在大鼠海马的CA3区增强了GluR6·PSD95·MLK3信号模块的组装；在KA刺激6h和12h GluR6·PSD95·MLK3的结合达到高峰，与生理盐水对照组相比具有显著性差异。

　　MLK3，MAPKKK家族的MLK亚家族成员，分子量为93ku，是细胞内丝/苏氨酸蛋白激酶。MLK家族成员通过调节MAPK激酶4和7(MKK4和MKK7)的磷酸化从而调节着JNK(cJun N端激酶)信号通路。PEI等[6]已证实脑缺血可以通过激活MLK3、MKK7导致JNK的活化，诱导神经元的死亡。SAVINAINEN等[3]的研究表明，在体外GluR6，PSD95和MLK3可以注射6h组；E、F TatGluR69c处理组。A、C、E (×40)；B、 D、F (×400). 标尺线段为200μm(E)和10μm(F)。

　　形成信号模块且促进了MLK3和JNK的磷酸化。本实验室研究结果显示，GluR6可通过激活MLK3、MKK3/MKK6和MKK4信号通路介导p38MAPK的活化，并最终导致了海马CA1区神经元的死亡[7]。本研究发现，KA诱导了大鼠痫性发作并使得大鼠海马CA3区的MLK3磷酸化水平在KA注射6h和1d出现峰值，表明在大鼠体内KA可通过GluR6·PSD95·MLK3信号模块激活MLK3，而且进一步的研究结果显示，激活的MLK3可通过MLK3MKK7JNK信号模块激活下游激酶的级联反应，最终诱导海马CA3区神经元的死亡。

　　近年来的研究表明，托吡酯(topiramate)保护了KA诱导的小鼠海马CA3区神经元的损伤，其通过降低pErk、caspase3的免疫反应性，却并未对pJNK和pP38产生影响[8]。HSIEH等发现[9]，在KA诱导的大鼠癫痫模型中钩藤(uncaria rhynchophylla)和钩藤碱(rhynchophylline)可以通过抑制JNK和NFkappaB的活化而减弱了癫痫的发作。本实验室前期的研究发现GluR6反义寡核苷酸对脑缺血导致的神经损伤具有一定的保护作用[10]。本研究利用含有HIV1 Tat蛋白转导序列与GluR6羧基末端的九个氨基酸的融合肽(TatGluR69c)，竞争并阻断GluR6与PSD95结合，观察MLK3磷酸化水平的变化。结果显示，该小肽完全可以结合到PSD95的PDZ1结构域，不仅抑制了GluR6·PSD95·MLK3信号模块的组装，而且抑制了KA注射6h MLK3的激活；TatGluR69c干预组大鼠2h内基本无癫痫发作。

　　总之，GluR6参与了癫痫发病的分子机制。它通过GluR6·PSD95·MLK3信号模块，激活了MLK3，并进而通过激活JNK信号通路，最终导致了神经元的损伤。TatGluR69c通过抑制该信号模块的组装，降低了MLK3的活化，发挥了对神经元的保护作用。随着癫痫发病的分子生物学机制的不断进展，KA受体也为发展抗癫痫药物提供了新的作用靶点。

参考文献

　　[1]MULLE C， SAILER A， PEREZOTANO I， et al. Altered synaptic physiology and reduced susceptibility to kainateinduced seizures in GluR6deficient mice [J]. Nature， 1998， 392(6676):601605.

　　[2]MEHTA S， WU H， GARNER CC， et al. Molecular mechanisms regulating the differential association of kainate receptor subunits with SAP90/PSD95 and SAP97 [J]. J Biol Chem， 2001， 276(19):1609216099.

　　[3]SAVINAINEN A， GARCIA EP， DOROW D， et al. Kainate receptor activation induces mixed lineage kinasemediated cellular signaling cascades via postsynaptic density protein 95 [J]. J Biol Chem， 2001， 276(14):1138211386.

　　[4]RACINE RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure [J]. Electroencephalogr Clin Neurophysiol， 1972， 32(3):281294.

　　[5]GUAN QH， PEI DS， LIU XM， et al. Neuroprotection against ischemic brain injury by SP600125 via suppressing the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis [J]. Brain Res， 2006， 1092(1):3646.

　　[6]PEI DS， WANG XT， LIU Y， et al. Neuroprotection against ischaemic brain injury by a GluR69c peptide containing the TAT protein transduction sequence [J]. Brain， 2006， 129(Pt 2):465479.

　　[7]CHEN J， LI C， PEI DS， et al. GluR6containing KA receptor mediates the activation of p38 MAP kinase in rat hippocampal CA1 region during brain ischemia injury [J]. Hippocampus， 2009， 19(1):7989.

　　[8]PARK HJ， KIM HJ， PARK HJ， et al. Protective effect of topiramate on kainic acidinduced cell death in mice hippocampus [J]. Epilepsia， 2008， 49(1):163167.

　　[9]HSIEH CL， HO TY， SU SY， et al. Uncaria rhynchophylla and rhynchophylline inhibit cJun Nterminal kinase phosphorylation and nuclear factorkappaB activity in kainic acidtreated rats [J]. Am J Chin Med， 2009， 37(2):351360.

　　[10]PEI DS， GUAN QH， SUN YF， et al. Neuroprotective effects of GluR6 antisence oligodeoxynucleotides on transient brain ischemia/reperfusioninduced neuronal death in rat hippocampal CA1 region [J]. J Neurosci Res， 2005， 82(5):642649.