一种新的胰腺炎脑损伤模型的建立

【摘要】 　　目的 建立一种稳定的胰腺炎并脑损伤模型，以进一步探讨胰腺炎脑损伤的机制。方法 24只成年雄性SD大鼠，随机分为假手术(sham operation， SO)组，重症急性胰腺炎(SAP)组和胰蛋白酶制模组(trypsin)，每组8只大鼠。各组大鼠均于制模后12h采集脑组织和胰腺组织标本。比较各组大鼠的死亡率；采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)测定血清细胞间紧密连接蛋白(Zo1)含量；透射电镜观察脑组织超微结构变化；HE染色观察脑组织病理学变化。结果 SAP组大鼠死亡率较trypsin组明显升高，SO组无大鼠死亡；SAP组Zo1水平均明显高于SO组(P<0.05)，trypsin组Zo1水平与SAP组呈现一致性变化(P>0.05)。SAP组和trypsin组均出现明显神经元细胞肿胀、毛细血管淤血、血管通透性增加、血栓形成、线粒体肿胀和细胞凋亡等超微结构的变化。结论 胰蛋白酶可能为SAP脑损伤的元凶；用胰蛋白酶制备SAP模型大鼠死亡率低，为进一步研究脑损伤的机制和进行相关治疗研究提供了稳定的动物模型。

【关键词】 重症急性胰腺炎；脑损伤模型；胰蛋白酶；Zo1

　　ABSTRACT: Objective To establish a stable brain injury model with pancreatitis and explore the mechanism of brain injury resulting from severe acute pancreatitis (SAP) in experimental rat models. Methods Twentyfour adult male SpragueDawley rats were randomly pided into three groups: sham operation (SO) group， SAP group and trypsin group， with eight rats in each. Brain tissue and pancreas tissue specimens were collected at 12 h after treatment. Death rate in each group was evaluated; the level of tight junction protein zonula occludens 1 (Zo1) was determined by enzymelinked immunosorbent assay. The ultrastructure of the brain tissues was examined using transmission electronic microscope; pathological changes in the brain tissues were observed with HE staining. Results The death rate was increased significantly in SAP group compared with that in trypsin group; no rats in SO group died. Zo1 level was obviously lower in SO group than in SAP group and trypsin group (P<0.05). The ultrastructural changes were seen in the latter two groups， including obvious neuronal cell swelling， capiliary stasis， increased vascular permeability， thrombosis and cell apoptosis. Conclusion Trypsin may cause brain injury with pancratitis. The death rate of SAP model established by trypsin was low. We have provided a stable animal brain injury model for further study and treatment of brain injury.

　　KEY WORDS: severe acute pancreatitis; brain injury model; trypsin; Zo1

　　胰性脑病(pancreatic encephalopathy， PE)是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis， SAP)严重并发症之一[1]。关于PE的发病机制，目前仍存在很多争议，多数学者认为它是由于胰酶自身激活、炎症因子和氧自由基过度释放、血流动力学改变和微循环障碍、ET1/NO比例失调、低氧血症、细菌感染、水电解质紊乱和维生素B1等多种因素综合作用的结果[23]。目前普遍认可的观点是在胰酶异位自身激活的基础上导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome， SIRS)，进一步引起脑组织缺血、缺氧性损伤，从而诱发PE。但是，我们在长期动物实验中发现，大鼠SAP脑损伤的病理特征与胰腺本身存在明显的一致性，主要表现为脑实质出血、灶状坏死和神经组织脱髓鞘改变。这些病理变化是以往理论无法解释的。我们设想SAP时大量激活的胰蛋白酶(trypsin)除破坏胰腺自身外，还进入血液循环并破坏血管壁的蛋白结构，从而使血管壁完整性遭到破坏，进一步引起器官出血。这可能是SAP时多器官损伤的始动因素。

　　另外，应用传统方法制造PE模型，由于SAP动物的死亡率过高，在很大程度上影响了对该疾病发病机制的研究。我们拟探讨一种新的制模方法，既能模拟PE的病理生理过程，又可以降低实验动物的死亡率，从而克服高死亡率对实验的影响。因此，本实验建立了一种稳定可靠、死亡率较低的脑损伤模型，以提高模型动物的生存率、更好地研究PE发生的病理生理机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　健康成年雄性SD大鼠24只，体重250～300g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供；牛磺胆酸钠、胰蛋白酶均购于Sigma公司；Zo1 ELISA检测试剂盒，由晶美生物工程有限公司提供；透射电镜为日本东芝公司产品。

　　1.2 实验动物分组与模型制作方法

　　24只成年雄性健康SD大鼠，随机分为假手术组(SO)、胰腺炎模型组(SAP)和胰蛋白酶制模组(trypsin)。大鼠禁食12h，禁水4h，25g/L戊巴比妥钠(1.2mg/kg)腹腔注射麻醉。动脉夹夹闭胰胆管近端和远端，40g/L牛磺胆酸钠(1mL/kg)经胰胆管逆行注射，保持1min后拔出穿刺针，取出动脉夹。SO组仅于开腹翻动十二指肠后缝合腹壁，并于阴茎背静脉注射生理盐水0.5mL/kg。trypsin组开腹翻动十二指肠后缝合腹壁，立即经阴茎背静脉注射25g/L胰蛋白酶(0.5mL/kg，胰蛋白酶以生理盐水溶解)。大鼠在制模后12h剖杀取材。

　　1.3 病理学观察

　　取脑组织和胰腺组织，经40g/L多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察脑组织和胰腺组织病理学改变。另取脑组织和胰腺组织1mm3，以25mL/L戊二醛4℃固定8h，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon812浸透，LKBV型超薄切片机进行超薄切片(50～70nm)，电镜下观察脑和胰腺组织超微结构改变。

　　1.4 血浆Zo1 ELISA检测

　　应用晶美生物工程有限公司提供的ELISA检测试剂盒检测血浆中Zo1含量，详细步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS13.0统计软件进行数据分析。大鼠死亡率应用χ2检验，组内比较用单因素方差分析，结果用均数±标准差(±s)表示，以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 大鼠12h死亡率

　　各组大鼠死亡率分别为SO组0.0%(0/8)、SAP组50.0%(4/8)、trypsin组12.5.3%(1/8)。trypsin组大鼠死亡率较SAP组死亡率明显降低(P<0.01)。

　　2.2 血浆Zo1含量

　　SAP组Zo1含量明显高于SO组(P<0.01)，trpysin组Zo1也明显高于SO组(P<0.05)，trypsin组和SAP组之间没有明显统计学差异(图1)。

　　2.3 胰腺和脑组织病理学改变

　　SO组胰腺无明显病理学改变。SAP组肉眼见胰腺片状坏死，胰周及网膜点状皂化斑，大量血性腹水；镜下胰腺实质坏死及炎性细胞浸润均较严重，提示SAP模型复制成功。SAP组胰腺组织透射电镜可见到典型细胞凋亡、线粒体肿胀、细胞水肿、毛细血管完整性破坏、通透性增加、毛细血管充血、血小板聚集、血栓形成等病理改变。trypsin组可见到胰腺结构基本存在，腺泡细胞肿胀，酶原颗粒减少，线粒体肿胀，间质肿胀并有大量炎细胞浸润，余结构基本正常(图2)。

　　SO组脑组织神经元、线粒体、小血管、神经纤维髓鞘等结构均无明显异常。SAP组可见神经元细胞明显肿胀，细胞核溶解，线粒体肿胀，胞质内细胞器结构破坏严重，神经纤维脱髓鞘样改变，小血管管壁完整性破坏，脑血管周围结构模糊不清，脑实质内可见灶状出血。trypsin组脑组织超微结构改变与SAP组相同(图3)。

　　3 讨论

　　对PE患者的尸检发现，其主要的病理变化有：①多灶毛细血管出血，血管周围水肿，毛细血管玻璃样变及坏死；②有脑梗死区及弥漫性脱髓鞘化；③有巨噬细胞反应，脑室管膜下胶质细胞增生；④大脑皮质、丘脑、脑桥、小脑或脑干可有出血点，脑灰质与白质邻近区有脱髓鞘改变[46]。这些病理改变与胰腺本身的病理变化相似，SAP时脑组织出现这些病理变化的原因用前述理论难以解释。炎症因子和氧自由基过度释放、血流动力学改变和微循环障碍、ET1/NO比例失调、低氧血症、细菌感染、水电解质紊乱等因素只会引起脑组织局部血管通透性增加，而不会破坏血管壁的完整性，从而引起局部出血和坏死。那么是什么原因引起了脑组织的出血和坏死性病理改变呢？我们在长期动物实验和复习文献的基础上得出了以下假说：重症急性胰腺炎时胰蛋白酶大量激活，破坏了胰腺本身，造成胰腺组织出血、坏死等病理改变；同时大量活化的蛋白酶随静脉血流进入血液循环，继而蛋白酶破坏血管壁上的蛋白结构，引起血管壁完整性破坏和通透性增加，最终导致了器官局部的出血和坏死性改变。炎症因子和氧自由基过度释放、血流动力学改变和微循环障碍、ET1/NO比例失调、低氧血症、细菌感染、水电解质紊乱等因素只是随之而来的激发因素，而非决定性原因[7]。
　　
　　Zo1是于1986年首次被报道的细胞间紧密连接蛋白[8]。近年来，学者们发现Zo1不仅构成血管屏障，而且参与了血管内外的物质转运、保持上皮极性、参与细胞分化与增殖及肿瘤细胞的转移等重要病理生理过程。Zo1主要表达于血管内皮，是血管屏障的重要组成部分，它在维持血管屏障的功能中发挥主要作用。它通常被看作是细胞骨架和血管屏障功能的标志物。

　　根据以上资料，我们推断急性胰腺炎导致紧密连接蛋白降解，造成细胞间隙明显增大，于是血液中的各种成分通过血管细胞之间的间隙进入组织中，进而引起组织损害，可能是SAP并发脑损伤的主要原因。2004年MARCUS SCHMITT等首次发现，紧密连接蛋白Zo1在急性胰腺炎时伴随胰腺组织水肿和血清胰酶含量升高发生降解，但缺乏进一步实验的证实，且急性胰腺炎时紧密连接蛋白降解的机制也未阐明。我们在应用胰蛋白酶成功复制出脑损伤模型后发现，随着血浆中Zo1水平的增高，脑损伤的程度也相应加重，尤以脑组织微血管的病理变化更加明显。提示由Zo1的降解所造成的脑血管完整性破坏参与了SAP脑损伤的病理过程，而且有可能是主要原因。这在很大程度上支持了我们的推论。此外，由蛋白酶复制出的脑损伤模型与应用牛磺胆酸钠复制的脑损伤模型在病理上具有明显一致性。这充分支持了我们提出的胰蛋白酶是脑损伤元凶的论断。

　　由于SAP动物的短期死亡率很高，这在很大程度上限制了我们对本病发病机制的研究。本实验中trypsin组死亡率明显低于SAP组，但是脑损伤的程度并不比SAP组低，这就为今后关于SAP脑损伤的机制研究提供了一种比较稳定的动物模型。

参考文献

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　　[4]许州，王春友. 胰性脑病发病机制及诊治研究进展 [J]. 医学综述， 2007， 13(14):10871089.

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　　[7]SHA H， MA Q， JHA RK. Trypsin is the culprit of multiple organ injury with severe acute pancreatitis [J]. Med Hypotheses， 2009， 72(2):180182.

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