乳腺癌癌旁组织中PCNA、cerbB2、p53、ER、PR基因的表达

　　　　 作者：贾宗良，林子晶，车向明，姚璐

【摘要】 　　目的 通过检测乳腺癌癌旁组织中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen， PCNA)、CerbB2、p53、雌激素受体(estrogen receptor， ER)﹑孕激素受体(progesterone receptor， PR)蛋白的表达，探讨适合中国女性保乳手术的安全切除范围。方法 收集40例乳腺癌根治术患者的切除标本，将每一标本分为癌肿区和癌旁区，癌旁区再划分为癌旁1cm、2cm、3cm及>3cm组。采用免疫组化SP法检测以上5组乳腺组织中非典型增生的发生率以及PCNA、cerbB2、p53、ER、PR蛋白表达的差异。结果 距离原发癌肿越远，癌旁组织发生非典型增生以及cerbB2、p53蛋白阳性的比例越低(P<0.05)；癌旁1cm、2cm组高危因素(非典型增生以及cerbB2、p53)的比例明显高于3cm组(P<0.05)，而癌旁1cm与2cm组间比较未见统计学差异(P>0.05)；PCNA、ER、PR在癌旁组织中的表达与组织分化、淋巴结转移无明显关系(P>0.05)。结论 在乳腺癌保乳手术中，推荐以癌旁2cm作为安全切除范围。

【关键词】 乳腺癌；保乳手术；非典型增生；增殖细胞核抗原；cerbB2；p53；雌激素受体；孕激素受体
　　ABSTRACT: Objective To detect the expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)， CerbB2， p53， estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) in order to explore the proper margin for breast conservative surgery on Chinese women. Methods We collected 40 resection specimens from breast cancer patients who had received radical surgery. Then we pided each specimen into primary tumor group and paracarcinoma group， the latter of which was further pided into 1cm， 2cm， 3cm and 3cmplus groups. Incidence of epithelial atypical hyperplasia and gene expression characteristics of PCNA， cerbB2， p53， ER and PR were measured by pathological and immunohistochemical assay in the five groups. Results With the further distance from the primary tumor， the proportions of highrisk disease and positive gene expressions of PCNA， cerbB2 and p53 in paracarcinoma tissues gradually decreased (P<0.05). Higher risk and more positive expressions were related to paracarcinoma 1cm and 2cm groups than 3cm groups (P<0.05); no significant difference was found between paracarcinoma 1cm group and 2cm group (P>0.05). There was no correlation of PCNA， ER and PR expressions adjacent to breast cancer with tissue differentiation and lymph node metastasis (P>0.05). Conclusion Based on our research， we recommend that paracarcinoma 2cm is a safe and appropriater region for breast conservative surgery.

　　KEY WORDS: breast cancer; breast conservative surgery; atypical hyperplasia; proliferating cell nuclear antigen; cerbB2; p53; estrogen receptor; progesterone receptor

　　乳腺癌保乳手术主要是指乳房肿瘤局部切除(肿块切除、腺叶切除、象限切除等)加腋淋巴结清扫。保乳手术切缘(margin) 是指原发灶切除后标本的边缘与癌组织间的镜下最短距离。获得原发灶切除后阴性切缘是乳腺癌保乳手术的一项基本要求， 其目的是切除病变乳腺中的可见肿瘤组织。大量文献报道， 切缘阳性会明显增加保乳手术的局部复发率。由于目前国内外关于乳腺癌原发灶累及范围的研究比较少，所以临床医师在行保乳手术时往往切除较多的癌旁组织以减少复发的概率。但是切除乳腺组织过多，会导致乳房外形修复不佳。本研究依据乳腺癌癌旁组织非典型增生﹑癌基因和抑癌基因蛋白异常表达情况，探讨乳腺癌保乳手术的安全切缘。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例资料

　　收集我院2007年8月至2007年9月间的40例乳腺癌根治术切除标本。入组患者均为女性，年龄24～72岁，平均42.3岁；肿瘤直径0.9～3.6cm，平均2.2cm；肿瘤位于外侧24例，内侧12例，中央4例；肿瘤表面皮肤出现酒窝征4例，湿疹样变1例，其他无异常表现35例。病理类型均为浸润性癌，其中浸润性导管癌32例，浸润性小叶癌1例，导管内癌5例，黏液癌1例，导管原位癌1例。腋窝淋巴结阳性6例，阴性34例；雌激素受体(ER)/孕激素受体(PR)阳性27例，阴性13例；cerbB2阳性24例，阴性16例。由于多中心性乳腺癌(在同一乳房内发生两个以上的肿瘤)目前认为是保乳手术的禁忌证，所以入组时剔除了这部分病例资料。

　　1.2 取材方法

　　40例乳腺根治术标本，以肿瘤中心与乳头连线及其垂直线上4个方向上取材，同时将每一患者标本分为癌肿区和癌旁区。以肿瘤及其周围区域0.5cm内为癌肿区组，癌旁区再划分为癌旁1cm、2cm、3cm及3cm以上组。每例标本均依上法分为5组制备蜡块并编号备用。

　　1.3 组织病理学观察
　　
　　对每例患者乳腺癌及其癌旁组织标本进行切片观察，对比两区域中乳腺非典型增生的发生率及程度。非典型增生分级标准，Ⅰ级(轻度)：上皮增生形成实性、乳头、筛状或腺型结构，细胞体积大于单纯增生，异型性不明显，排列有极性，双层结构明显。Ⅱ级(中度)：除上述异型结构外，腺管直径扩大，细胞体积明显增大，轻度异型性，细胞排列紊乱，边缘一层仍保持极性，双层结构存在。Ⅲ级(重度)：增生形式同上，管径明显扩大，增生的腺管互相贴近、成团，细胞体积明显增大，有一定异型性，细胞排列紊乱或仅留极性现象，双层结构消失或偶见。按以上标准，光镜下观察乳腺癌及癌旁乳腺组织的非典型增生及癌浸润情况。

　　1.4 指标检测方法

　　采用免疫组化SP法。鼠抗人增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体(福州迈新生物技术开发有限公司产品)采用1∶100浓度稀释；鼠抗人ER、PR单克隆抗体、鼠抗人cerbB2单克隆抗体(北京中杉生物技术开发有限公司产品)采用1∶50浓度稀释。SP试剂盒购自北京中杉生物技术开发有限公司。步骤如下：石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱水，PBS冲洗3次，每次5min；h3O2阻断内源性过氧化酶，室温下孵育10min，消除非特异性染色；分别加一抗，冰箱4℃过夜，PBS冲洗3次，每次5min；链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min；DAB显色，室温3～10min，自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。两人双盲法观察切片，选取至少5个代表性高倍视野(不少于1000个细胞)，对免疫组化结果进行评估。PCNA、ER、PR p53以细胞质内或核内有棕色颗粒为阳性细胞，CerbB2以细胞膜呈棕色反应为阳性。

　　1.5 统计学方法

　　所有资料都应用SPSS10.0软件进行统计分析。计数资料的组间比较采用χ2检验，检验水准为α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 癌旁不同范围非典型增生发生率的比较

　　在40例标本中，癌旁1cm、2cm、3cm及3cm以上组，非典型增生的发生率分别为62.5%、52.5%、35%和25%。经统计学分析，1cm组与2cm组之间以及3cm组与3cm以上组之间的差异无统计学意义(P>0.05)，而1cm、2cm组与3cm组之间差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 癌旁不同范围PCNA、cerbB2、p53的表达情况

　　距离原发病灶越远，癌旁组织检测出PCNA、cerbB2、p53阳性表达的比例就越低(图1～图3，P<0.05)。设定出现非典型增生(Ⅱ、Ⅲ级)或PCNA、cerbB2、p53任一阳性即为高危病例，可以发现癌旁1cm组及2cm组高危病例的比例明显高于3cm组及>3cm组(P<0.05)，而1cm组与2cm组之间没有明显差异(P>0.05)。

　　2.3 癌旁不同方向高危病例的出现情况

　　沿癌旁4个不同的方向(近乳头端、远乳头端、肿瘤两侧)，距离越远，高危病例出现的比例越低。近乳头端、肿瘤两侧端在不同范围内可见统计学差异(P<0.05)，而远乳头端在不同范围内未见统计学差异(P>0.05)。两两比较，近乳头端组、肿瘤两侧端组危险因素阳性病变均较远乳头端组范围广泛(P<0.05，表1)。表1 癌旁不同方向危险因素的比较（略）

　　2.4 非典型增生及PCNA、cerbB2、p53、ER/PR表达与切除范围的关系
　　在40例标本中非典型增生以及PCNA、cerbB2、p53、ER/PR的阳性例数分别为25(62.5%)、17(42.5%)、24(60%)、19(47.5%)、27(67.5%)(图4)。同时，在癌旁1cm处，非典型增生(Ⅱ、Ⅲ)、PCNA、cerbB2、p53、ER/PR的阳性例数分别为12、15、19、18、16例；相应的癌旁2cm分别为9、11、15、18、13例；癌旁3cm则为4、6、6、0、9例。由此我们发现，非典型增生(Ⅱ、Ⅲ)、cerbB2、p53的阳性例数随着癌旁距离的增大而越低，并且均与原发癌表达阴性者存在统计学差异(P<0.05)。而PCNA、ER/PR则未见与癌旁组织高危因素间存在明显的统计学差异(P>0.05，表2)。表2 不同范围危险因素与原发癌之间的关系（略）

　　2.5 癌旁不同距离高危因素与腋窝淋巴结、患者年龄、肿瘤大小之间的关系

　　考虑到乳腺癌临床保乳手术时年龄、腋窝淋巴结是否转移、肿瘤大小可能存在的影响，故特进行统计学检验。设组时将年龄分为>40及≤40岁组，肿瘤大小分为≤2及>2cm组，腋窝淋巴结转移情况分为阳性及阴性组。在40例标本中，年龄因素、腋窝淋巴结是否转移、肿瘤大小与癌旁不同距离高危因素间未见明显的统计学差异(P>0.05，表3)。表3 患者年龄、肿瘤大小、腋窝淋巴结与高危因素之间的关系（略）

　　3 讨 论

　　乳腺癌保留乳房手术中，肿瘤的切除原则要求“切缘阴性”，但是在实际手术过程中，切除范围包括肿瘤以及周围1cm的乳腺组织。从组织学观察，就有21%的癌旁区镜下残存癌细胞，所以从形态学上考虑，1cm作为癌旁切除范围是不充分的。因此，相当数量的乳腺癌患者术后局部复发，提示在肿瘤切除边缘，虽然没有镜下可以辨认的癌细胞，但可能存在生物学行为或基因水平潜在癌变的细胞。

　　乳腺癌的发生发展是一个多阶段演进、多基因改变参与的渐进过程。其内在机制在于癌基因与抑癌基因之间失去平衡，表现为多个癌基因的异常激活和编码蛋白过度表达以及抑癌基因的缺失、突变失活，导致细胞增殖失控而恶性转化。本研究通过检测并统计乳腺癌旁不同距离乳腺组织非典型增生的发生率以及PCNA、cerbB2、p53、ER/PR基因的表达，并设定非典型增生、PCNA、cerbB2、p53出现任一阳性者为高危病例，最终发现，距离原发癌肿越远，癌旁组织发生非典型增生以及cerbB2、p53基因阳性的比例越低(P<0.05)，癌旁1cm、2cm处危险因素阳性的比例明显高于3cm及﹥3cm处(P<0.05)，而癌旁1cm与2cm间未见统计学差异(P>0.05)。所以在乳腺癌保乳手术中，我们推荐以癌旁2cm作为安全切除范围。

　　大量文献报道，乳腺上皮非典型增生与乳腺癌的发生密切相关[1]。本研究发现，在乳腺癌周围乳腺组织中存在大量的非典型增生，而且离原发癌灶越近，非典型增生的发生率及严重程度越高，且差异有统计学意义(P<0.05)。

　　cerbB2基因是乳腺癌中最常见的原癌基因之一。在乳腺癌中cerbB2的膜表达是其癌基因扩增的结果，阳性表达多见于分化差和浸润性乳腺癌。文献报道，cerbB2的过度表达与癌细胞的分化、细胞学类型、淋巴结转移及预后有关[2]。本研究发现，距离原发癌灶越远，cerbB2表达的阳性率越低(P<0.05)。

　　p53基因位于17号染色体短臂上，野生型p53基因能抑制细胞转化，并能抑制癌基因的活动，而突变型p53基因可引起细胞的转化和癌变。p53基因突变可能是乳腺癌病情进展恶化的重要因素[34]。本研究发现，距离原发癌灶越远，p53表达的阳性率越低且存在统计学差异(P<0.05)。p53蛋白表达是乳腺癌发生的始动因素之一，是判断乳腺良恶性病变的参考指标，但对乳腺癌预后无特异性。

　　PCNA是瘤细胞增生活跃的指标[56]，是判断乳腺癌预后的有效标记物。PCNA的表达与瘤细胞的生物学行为密切相关，阳性表达者，特别是阳性强度为～时，预后较差，应给予术后综合治疗。

　　年龄、腋窝淋巴结是否转移、肿瘤大小[7]对于保乳手术切缘阳性的影响尚无定论。本研究结果显示，年龄、腋窝淋巴结是否转移、肿瘤大小尚不能影响癌旁危险因素(P>0.05)。因此，外科医师在行保乳手术时，不必因为患者年龄、腋窝淋巴结是否转移、肿瘤大小的缘故而增大或缩小切除范围。

参考文献

　　[1]阚秀. 乳腺的临界性病变-非典型增生 [J]. 诊断病理学杂志， 1996， 3(1):36.

　　[2]PAULETTI G， DANDEKAR S， RONG HM， et al. Assessment of methods for tissuebased detection of the HER2/neu alteration in human breast cancer:a direet comparison of fluoreseence in situ hybridization and immunohistochemistry [J]. Clin Oneol， 2000， 18(21):36513664.

　　[3]GAO RJ， BAO HZ， YANG Q， et al. The presence of serum antip53 antibodies from patients with invasive ductal carcinoma of breast: correlation to other clinical and biological parameters [J]. Breast Cancer Res Treatment， 2005(93):111115.

　　[4]张素华，孙瑞军，向聚才. 乳腺病变的PCNA、p53表达及其应用价值研究 [J]. 中国肿瘤临床， 1999， 26(10):750752.

　　[5]TORBEN H， GRETE KJ， KARIN Z. Correlation of growth fraction by Ki67 and proliferatating cell nuclear antigen (PCNA) immunohistochemistry with histopathological parameters and prognosis in primary breast carcinomas [J]. Virchows Arch， 1998(433):223228.

　　[6]刘君，方志沂，石松魁. 保乳手术治疗乳腺癌 [J]. 实用癌症杂志， 2003， 18(4):403405.

　　[7]SINGLETARY SE. Surgical margins in patients with earlystage breast cancer treated with breast conservation therapy [J]. Am J Surg， 2002， 154(5):353393.