益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者sEPCR及CD62P的影响

　　 作者：吴喜利，张王刚，石兴民，安鹏，孙万森，王竹，乔成林

【摘要】 　　目的 观察益肾胶囊对慢性肾小球肾炎(慢性肾炎，chronic glomerulonephritis， CGN)患者血浆可溶性内皮细胞蛋白C受体(soluble endothelium protein C receptor， sEPCR)、P选择素(Pselectin， CD62P)及血清免疫球蛋白(Ig)、补体3水平的影响。方法 分别采用酶联免疫双抗体夹心法、流式细胞仪及免疫比浊法检测了40例健康查体者和78例患者治疗前后血浆sEPCR、CD62P及血清免疫球蛋白(Ig)、补体3水平的改变。结果 治疗前慢性肾炎患者血浆sEPCR、CD62P及血清IgA水平均明显升高(P<0.01)，血清IgG、IgM及补体C3水平明显降低(P<0.01)，经过3个月的治疗，治疗组患者血浆sEPCR、CD62P及血清IgA水平明显下降(P<0.05或P<0.01)，IgG、IgM及补体C3明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论 益肾胶囊治疗CGN患者的作用机制之一可能与降低血浆sEPCR、CD62P水平及调节血清IgA、IgG、IgM和补体C3水平有关。

【关键词】 益肾胶囊；慢性肾小球肾炎；可溶性内皮细胞蛋白C受体；P选择素

　　ABSTRACT: Objective To explore the effects of Yishen Capsule on the soluble endothelium protein C receptor (sEPCR) and Pselectin (CD62P) as well as the serum levels of immunoglobulin (Ig) and complement 3 (C3) in patients with chronic glomerulonephritis (CGN). Methods The changes of sEPCR and CD62P levels in plasma as well as Ig and C3 levels in serum were assessed in 40 normal subjects and 78 patients before and after treatment by doubleantibody enzymelinked immunosorbent assay， flow cytometry and immunoturbidimetry， respectively. Results Compared with those in normal group before treatment， the levels of sEPCR and CD62P in plasma as well as IgA in serum increased obviously (P<0.01)， and the levels of IgG and IgM as well as C3 in serum decreased significantly in CGN patients (P<0.01). After three months treatment with Yishen Capsule， the levels of sEPCR and CD62P in plasma and IgA in serum decreased significantly (P<0.05 or P<0.01)， and the levels of IgG and IgM in plasma as well as C3 in serum increased obviously (P<0.05 or P<0.01). Conclusion The mechanism of Yishen Capsules effect in treating patients with CGN may be correlated with decreasing sEPCR and CD62P levels in plasma as well as regulating the levels of Ig in serum and C3.

　　KEY WORDS: Yishen Capsule; chronic glomerulonephritis; soluble endothelium protein C receptor (sEPCR); Pselectin (CD62P)

　　慢性肾小球肾炎(慢性肾炎，chronic glomerulonephritis， CGN)是由多种原因引起的一组临床表现相似、病理改变不一、预后不尽相同，易复发的常见难治性免疫性疾病。中医药治疗该病有明显的特点和优势。随着研究的不断深入，肾病工作者报道了大量的临床经验[15]。在以往的研究中，我们观察到陕西省名老中医乔成林教授根据多年临床经验研制的益肾胶囊具有明显减少CGN患者尿蛋白，降低血清白细胞介素6(interleukin 6， IL6)、IL8、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)水平[67]、调整患者T淋巴细胞亚群比例失衡、预防CGN复发[89]及修复受损的肾小球系膜细胞和抑制肾组织核转录因子κB(nuclear factorκB， NFκB)、血小板来源的生长因子β(plateletderived growth factor beta， PDGFβ)的表达[10]等作用。为进一步明确该方药对慢性肾小球肾炎的具体作用机制，我们观察了益肾胶囊对CGN患者血浆可溶性内皮细胞蛋白C受体(soluble endothelium protein C receptor， sEPCR)、P选择素(Pselectin， CD62P)及血清免疫球蛋白(Ig)、补体3的影响。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　病例选择2006年3月至2008年6月间本院住院及门诊患者，78例均为慢性原发性肾小球疾病，并根据临床实验室检查除外了继发性肾小球疾病，如狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、高血压性肾小球改变等，所有病例符合诊断标准[11]。在78例CGN患者中，男46例，女32例，男：女为1.44∶1；年龄最小者16岁，最大者42岁，平均年龄25.4岁，肾功能均正常。研究其间病情平稳，未见感染情况发生，采血前及研究其间均未服用任何免疫反应的药物。对照组40例均为健康查体者，男21例，女19例，男∶女为1.11∶1，年龄最小者15岁，最大者46岁，平均年龄为27.5岁。

　　1.2 治疗方法

　　益肾胶囊系由西安交通大学医学院第二附属医院制剂室提供，陕药制字[2001]第1424号，组成包括黄芪、党参、熟地、山芋、山药、仙鹤草、茯苓、泽泻、潼蒺藜等。口服，每次3粒(每粒含生药0.38g)，一日3次，连续用药3个月。用药前和停药后1周分别做相关指标检测。

　　1.3 血浆CD62P及sEPCR的检测

　　研究对象于晨8点抽取肘静脉血2mL，采血后30min立即送检，加入2mL枸橼酸钾保养液轻微混匀，试剂为法国Immunotech的单抗产品CD62PPE。取A、B二个试管，A试管中加入20μL IgGFITC/IgGPE，B试管中加入20μL CD62PPE，然后分别加入100μL PBS(0.01mmol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.2)，再在每管中各加入5μL全血，避光15min后，加入10g/L多聚甲醛2mL固定，用四色荧光流式细胞仪进行检测。以荧光强度的几何均数表示外周血血小板中CD62P的表达水平，结果以荧光密度表示；采用酶联免疫双抗体夹心法检测血浆sEPCR，按试剂盒说明书进行操作(ELISA试剂盒购于Peprotech， USA)。

　　1.4 血清免疫球蛋白(Ig)及补体3的检测

采用免疫比浊法检测血清IgA、IgG、IgM及补体3(C3)水平，具体步骤按试剂盒说明书进行操作(试剂盒购自新湾生物科技有限公司)。

　　1.5 统计学分析

　　所有数据均用±s表示，运用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，采用完全随机t检验，P<0.05为具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 益肾胶囊对CGN患者血浆sEPCR及CD62P水平的影响

　　治疗组治疗前与对照组比较，患者血浆sEPCR及CD62P水平明显升高(P<0.01)，经过治疗患者血浆sEPCR及CD62P水平均明显降低(P<0.05或P<0.01，表1)。表1 益肾胶囊对CGN患者血浆sEPCR及CD62P水平的影响（略）

　　2.2 益肾胶囊对CGN患者血清免疫球蛋白及补体3的影响

　　治疗组治疗前与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)；治疗前后比较，血清IgA明显下降(P<0.05)，IgG、IgM及补体C3明显升高(P<0.05或P<0.01，表2)。表2 益肾胶囊对CGN患者血清免疫球蛋白及补体3的影响（略）

　　3 讨 论

　　CGN的发病原因是多方面的，其病程长，病症复杂，使其辨证分型很难统一。但临床上以阴虚、气虚为最多见，而阴虚、气虚与瘀血有着必然的联系。血的运行需津液的运载，水津充肺，血始能行，津亏不足以载血，血行涩滞易形成瘀血。且CGN常因外感起病，既成之后又发生肺、脾、肾等脏腑功能失调，水液代谢障碍，湿浊俱下，或扰于下焦，致封藏失职，而成蛋白尿。可见本病虚实夹杂，本虚标实，脏腑功能失调与病邪稽留并存。根据以上分析，我们针对CGN的虚、浊、瘀等病机变化，而立法组方制成院内制剂益肾胶囊，并在以往研究的基础上[610]，进一步观察其对患者血浆sEPCR、CD62P及血清免疫球蛋白(Ig)、补体3水平的影响。方中六味地黄丸滋阴补肾；党参、黄芪益气扶正；潼蒺藜补肾益精，收涩固精；仙鹤草活血消肿；甘草和中解毒；诸药合用益气养阴，活血清利可兼顾其邪实，长期使用不伤正气。现代药理学研究认为六味地黄丸具有调节神经内分泌免疫调节网络平衡、保护肝脏和调节肾脏功能等作用[12]；黄芪可增加抗体的产生和NK细胞的活性，诱导干扰素的产生及促进中性粒细胞趋化运动和淋巴细胞的转化，提高非特异免疫功能[13]；有研究还认为黄芪能降低全血比黏度、纤维蛋白原，抑制血小板的积聚，改善CGN患者的血液流变学[14]，改善全身及肾脏的血流动力学[15]，降低尿蛋白[16]，通过T细胞介导增强患者的细胞免疫功能[17]，对CGN有较强的对证性和多环节的治疗作用。

　　CD62P又称P选择素，是一种膜糖蛋白，储存于循环巨核细胞、静止血小板的α颗粒和内皮细胞的WeibelPalade小体，血小板和内皮细胞的表面不存在CD62P。静止组织发生炎症或其他损伤时，血小板α颗粒和内皮细胞的WeibelPalade小体迅速与质膜融合而使CD62P在血小板和内皮细胞表面表达，是血小板活化的特异标志物质，能敏感、准确地反映血小板活化程度。因此，CD62P可作为内皮细胞和血小板活化的标志[18]。有研究证实肾小球疾病中CD62P不仅在活化的血小板上而且在肾小管上皮上也广泛表达，特别是在炎症病变与细胞增生明显的增生性肾小球肾炎中尤为显著，并与患者血浆CD62P水平增高相一致[1920]。sEPCR是蛋白(protein C， PC)的内皮细胞表面受体，是一种依赖维生素K的血浆Ⅰ型跨膜糖蛋白，以非活性形式在肝脏合成[21]。sEPCR表达在内皮细胞上，结合蛋白C和活化蛋白C的Gla结构域，通过内皮细胞表面的凝血酶TM复合物提高蛋白C的活化率。研究表明[22]，sEPCR参与了败血症疾病过程中炎症反应的调节，因为阻断sEPCR蛋白C间相互作用，可使凝血和炎症反应加剧活化的蛋白C(activated protein C， APC)与EPCR的结合，可使APCEPCR复合物发生转移至细胞核[23]，说明APC可能介导了细胞内的信号转导事件。而免疫球蛋白(Ig)是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的蛋白，普遍存在于血液与组织液中，在体液免疫中起主要作用。在肾小球肾炎疾病中，参与免疫复合物变态反应的抗体多为IgG。此外，还有IgM、IgA和抗原抗体复合物在血流中形成可溶性复合物。这种复合物形成后，与补体(尤其C3)相结合，沉积于肾小球基膜上，导致血浆补体C3消耗增加，血浆C3下降。免疫反应激活在基膜上沉积的补体C3，可使肾小球基膜受损，导致毛细血管通透性增加及毛细血管管腔变窄，甚至发生阻塞等病理改变。

　　本研究显示，治疗前患者血浆sEPCR、CD62P及血清免疫球蛋白(Ig)、补体3水平与对照组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，表明它们与CGN的调控免疫应答有关。经过益肾胶囊3个月的治疗，患者血浆sEPCR、CD62P及血清IgA水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)，IgG、IgM、C3较治疗前明显升高(P<0.05或P<0.01)，益肾胶囊治疗CGN患者的作用机制之一可能与降低血浆sEPCR、CD62P及调节IgA、IgG、IgM和补体C3水平有关。

参考文献

　　[1]李有田，迟宝荣，李洋，等. 中药慢肾灵治疗慢性肾小球肾炎疗效评价 [J]. 吉林大学学报：医学版， 2003， 28(4):489490.

　　[2]罗萍，李艳辉，刘树军，等. 东北雷公藤对肾小球肾炎治疗作用的实验研究 [J]. 吉林大学学报：医学版， 2003， 28(5):606608.

　　[3]崔冰，刘晓城，张俊，等. 姜黄素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖及纤维连接蛋白表达的影响 [J]. 郑州大学学报：医学版， 2006， 41(4):683685.

　　[4]吴歌，张有才，刘章锁，等. 参芪扶正注射液对糖尿病大鼠肾脏的保护作用 [J]. 郑州大学学报：医学版， 2000， 34(6):540542.

　　[5]关晓东，吴宇芳，赵文. 火把花根片联合厄贝沙坦治疗IgA肾病的临床观察 [J]. 西医结合">中西医结合学报， 2005， 3(5):366369.

　　[6]吴喜利，孙万森，乔成林，等. 益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者尿蛋白及免疫功能的影响 [J]. 广州中医药大学学报， 2004， 21(2):98101.

　　[7]吴喜利，乔成林，孙万森，等. 益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者尿蛋白及NK细胞的影响 [J]. 第四军医大学学报， 2003， 24(17):15191591.

　　[8]吴喜利，孙万森，张王刚，等. 益肾胶囊对系膜细胞增殖性肾小球肾炎大鼠肾脏NFκB及PDGFβ表达的影响 [J]. 西安交通大学学报：医学版， 2007， 28(3):293296.

　　[9]WU XL， SUN WS， ZHANG WG， et al. Study on effect of Yishen Capsule in preventing recurrence of chronic glomerulonephritis [J]. Chin J Integr Med， 2007，13(3):215218.

　　[10]吴喜利，孙万森，张王刚，等. 益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者血清血管内皮生长因子及细胞免疫的影响 [J]. 中国中药杂志， 2007， 32(22):24162418.

　　[11]叶任高. 内科学 [M]. 北京：人民卫生出版社， 2001:528530.

　　[12]齐春会，张永祥，沈倍奋. 六味地黄方现代药理学研究新进展 [J]. 军事医学院院刊， 2002， 26(1):5761.

　　[13]陈莉芬，李荣亨，曹文富，等. 黄芪对慢性肾炎患者血清TNFa、IL6及细胞免疫功能的影响 [J]. 重庆医科大学学报， 2002， 27(2):174176.

　　[14]沈波，郑华，田树敏. 黄芪注射液对慢性肾炎患者血液流变学的影响 [J]. 上海医药， 1999， 20(9):1516.

　　[15]马骥，彭艾，陈靖，等. 黄芪对肾病综合征与充血性心力衰竭时血管加压素系统异常的不同改善作用 [J]. 中华肾脏病杂志， 1996， 12(1):1519.

　　[16]王晋弘. 黄芪注射液治疗慢性肾小球肾炎尿蛋白的临床研究 [J]. 中医药研究， 2002， 18(3):2222.

　　[17]黄海平，刘翠华. 黄芪对小鼠免疫功能作用的实验研究 [J]. 内蒙古中医药， 2008， 27(6):5354.

　　[18]SUZUKI H， ABE K， TOJO S， et al. Expressions of Pselectin and HSP72like immunoreactivities in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion [J]. Brain Res， 1997， 759(2):321329.

　　[19]薛勤，周继生，汪年松，等. P选择素在原发性肾小球肾炎发病中的临床意义 [J].临床内科杂志， 2006， 23(1):737738.

　　[20]WANG JH， DUN XP， QU LN， et al. Preparation and identification of monoclonal antibodies against pea albumin 1b (PA 1b) [J]. Hybridoma (Larchmt)， 2005， 24(4):197200.

　　[21]KOARADA S， TSUNEYOSHI N， HARUTA Y， et al. Effect of disease activity and corticosteroids on serum levels of soluble endothelial cell protein C receptor in patients with systemic lupus erythematosus [J]. Mod Rheumatol， 2009， 19(2):173179.

　　[22]PRESTON RJ， AJZNER E， RAZZARI C， et al. Multifunctional specificity of the protein C/activated protein C Gla domain [J]. J Biol Chem， 2006， 281(39):2885028857.

　　[23]ESMON CT. Role of coagulation inhibitors in inflammation [J]. Thromb Haemost， 2001， 86(1):5156