作者：张广彬，陈宪民，李海燕，于洪玲，孙四娟，唐玉海
【摘要】 目的 建立一种快速、准确、高灵敏度的检测含巯基药物的化学发光分析方法。方法 在硫酸酸性介质条件下，高锰酸钾可与乙二醛产生化学发光，而含巯基药物对该化学发光有显著的增强作用，基于此现象建立了流动注射化学发光分析法测定含巯基药物的新方法。结果 实验对影响化学发光的可能因素和参数进行了优化，在优化的条件下，甲巯咪唑、卡托普利和乙酰半胱氨酸分别在1.0×10-8～5.0×10-6、7.0×10-8～1.0×10-6和3.0×10-8～1.0×10-6g/mL浓度范围内与相对化学发光强度成良好的线性关系，检测限分别为1.0、3.9、3.7ng/mL。结论 本方法已成功应用于3种含巯基药物制剂的含量测定，与药典方法比较，结果满意。
【关键词】 流动注射；化学发光；含巯基药物
ChinaABSTRACT: Objective To establish a rapid， accurate and sensitive chemiluminescence method for determining sulfydryl-containing drugs. Methods In sulfuric acid solution， glyoxal could be oxidized by potassium permanganate， and weak chemiluminescence could be observed. Chemiluminescence signal could be enhanced in the presence of sulfydryl-containing drugs. Thus， on this basis we established a new method of determining the concentration of sulfydryl-containing drugs with flow injection chemiluminescence analysis. Results Under the optimized conditions， the linear range of methimazole， captopril and acetylcysteine was 1.0×10-8- 5.0×10-6， 7.0×10-8-1.0×10-6 and 3.0×10-8-1.0×10-6g/mL， respectively. The limit of detection of methimazole， captopril and acetylcysteine was 1.0， 3.9 and 3.7ng/mL， respectively. Conclusion The method was successfully applied to determine the three drugs that contain sulfydryl. Compared with the results of pharmacopeia methods， the results we obtained were satisfactory.
KEY WORDS: flow injection; chemiluminescence; sulfydryl-containing drug
含巯基药物是指药物分子内含有-SH基团的一类化合物，主要是硫醇和硫酚类药物(图1)，这些化合物分子中的巯基很容易被氧化成亚磺酸或者磺酸。巯基是机体内非常重要的活性基团，体内含巯基的化合物有两类，一类是含巯基的蛋白质，另一类是含巯基的非蛋白质化合物，其中最重要的是谷胱甘肽。因此，建立一种简单、准确的测定巯基化合物含量的方法非常重要。目前，含巯基化合物的检测方法主要有气质联用仪、高效液相色谱法、液质联用法、分光光度法、伏安法、化学发光法、荧光分析法、电化学分析法[1-10]等，但这些分析方法中有的过程比较繁琐，有的需要仪器比较昂贵、灵敏度较低。本研究根据巯基(-SH)易被氧化的性质，结合流动注射化学发光分析技术，建立了一种快速、简便、高灵敏度的测定含巯基药物含量的分析方法，并已成功应用到三种巯基化合物——甲巯咪唑、卡托普利、乙酰半胱氨酸药物制剂的含量测定中，同时对其可能的化学发光机理进行了初步的探讨。
1 材料与方法
1.1 仪器、药品及试剂
IFFM-E型流动注射化学发光仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司)；IFFS-A型多功能化学发光检测器(西安瑞迈分析仪器有限责任公司)。实验中使用的连接管均为聚四氟乙烯管(0.8mm i.d.)。
甲巯咪唑、卡托普利、乙酰半胱氨酸对照品(中国药品生物制品检验所)；高锰酸钾(西安化学试剂厂)；乙二醛(天津福晨化学试剂厂)；甲巯咪唑片(上海中西制药有限公司，批号：071102)；卡托普利片(广州白云山制药股份有限公司，批号：1060005)；乙酰半胱氨酸泡腾片(Zambon S.p.A.，批号：08A05/01)。
高锰酸钾储备液(0.01mol/L)：精密称取0.16g高锰酸钾，用水溶解后定容至100mL；乙二醛(0.01mol/L)：精密量取5mL乙二醛试剂(400g/L)，用水定容至100mL；样品储备液(1.0×10-4g/mL)：精密称取0.01g样品，用水溶解后定容至至100mL，分析时用水稀释至所需浓度。实验所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。
1.2 方法
本实验采用反相流动注射技术，其流路如图2所示。乙二醛溶液与样品或者空白溶液通过六通阀混合后，再与高锰酸钾溶液通过三叉管混合后进入流通池，产生的光信号被光电倍增管检测，利用仪器所配置的工作站进行数据处理。在优化的条件下，以二次蒸馏水为空白溶液，测得的发光谱图峰高为空白信号I0，以样品溶液测得的峰高为样品信号I，所得到的相对化学发光强度(ΔI=I-I0)与样品的浓度(c)在一定范围内具有线性关系，据此进行定量分析。本实验采用单因素优化法对影响化学发光的因素进行优化，即每次实验优化中只考虑一个因素的变化，在其他影响因素不变的情况下，确定此因素最佳值后，再逐一优化其他影响因素。
2 结 果
2.1 优化条件
本实验以甲巯咪唑为例对主要影响因素在一定范围内进行优化。
2.1.1 高锰酸钾浓度的优化
考察在0.1～1.6mmol/L范围内高锰酸钾浓度对体系相对化学发光强度的影响。随着高锰酸钾浓度增加，相对化学发光强度随之增加，当高锰酸钾浓度大于1.0mmol/L时相对化学发光强度不再增加。因此，实验选择1.0mmol/L高锰酸钾溶液。
2.1.2 反应介质及其浓度的优化
实验中考察了相同浓度的HNO3、HCl、H3PO4、h3SO4和甲酸等酸性介质对相对化学发光强度的影响。观察到在HNO3、HCl和h3SO4酸性介质中可以产生化学发光，但是只有在h3SO4酸性介质条件下产生的化学发光信号稳定，且相对化学发光强度最大，所以选择硫酸为反应的介质。在0.025～0.15mol/L范围内，考察了不同浓度的硫酸对体系相对化学发光强度的影响。结果表明，硫酸浓度在0.075mol/L时具有最大相对化学发光强度。因此，实验选择0.075mol/L硫酸作为反应的介质。
2.1.3 乙二醛浓度的优化
乙二醛浓度对化学发光强度影响很大。本实验研究了在2.5～25mmol/L范围内乙二醛对发光信号的影响。实验结果显示，随着乙二醛浓度的增加，相对化学发光强度也增加，直到0.01mol/L；再提高乙二醛浓度，相对化学发光强度减小，信噪比和重现性较差。故本实验乙二醛优化浓度选择0.01mol/L。
2.1.4 泵1与泵2的流速比的优化
为了考察不同比例的试剂混合对体系发光强度的影响，本实验对泵1与泵2的流速比在0.6～1.6范围进行优化。结果表明，流速比在1.0时具有最大相对化学发光强度。
2.1.5 泵2流速的优化
由于化学发光反应受流速影响很大，一般说来反应速度越快，发光强度越高。本实验选择在1.62～3.59mL/min范围，对泵2流速进行优化。结果表明，流速在2.82mL/min时具有最大相对化学发光强度。因此，接下来实验选择2.82mL/min为优化条件。
2.1.6 混合管长度的优化
化学发光反应速度很快，反应混合后的距离长短至关重要，太长或太短都可能检测不到光信号。本实验在0～17cm范围优化。结果表明，混合管长度在11cm时具有最大相对化学发光强度。因此，实验选择11cm为优化条件。
2.2 方法学考察
本实验根据Q2(R1)[11]进行了以下方法学考察。
2.2.1 线性范围、回归方程、相关系数
在优化的条件下，3种含巯基药物在一定范围内与相对化学发光强度具有良好的线性关系，其结果如表1所示。表1 3种巯基化合物的标准曲线方程及相关系数（略）
2.2.2 回收率与精密度
回收率实验是采用对不同浓度的对照品进行测定，结果如表2。精密度实验是对低、中、高浓度的甲巯咪唑、卡托普利和乙酰半胱氨酸分别进行连续10次平行测定，所得到的相对标准偏差(RSD)分别为1.5%、3.9%和2.7%。表2 3种巯基化合物的回收率实验（略）
2.2.3 检测限(LOD)与定量限(LOQ)
检测限与定量限根据以下公式计算：LOD=3.3σ/S和LOQ=10σ/S，所得甲巯咪唑、卡托普利和乙酰半胱氨酸的检测限分别为1.0、3.9和3.7ng/mL；定量限分别为3.0、11.7和11.1ng/mL。
2.2.4 专属性
在选定的优化条件下，以1.0×10-5μg/mL采取标准加入法，规定相对标准偏差小于3%为干扰界限。结果表明，1000倍K+、Na+、NO-3、Mg2+、Ca2+和Ba2+，50倍PO3-4、SO2-4、Fe2+、CO3-2和Cl-，500倍葡萄糖、蔗糖、淀粉、硬脂酸镁和糖精，对测定含巯基药物没有干扰。
2.2.5 稳定性
实验中所使用的试剂在放置1周内使用不干扰实验，但发现温差变化较大时可以影响发光强度值。实验过程中，应在尽量恒温的条件下。
2.3 应用
本方法成功地应用于3种含巯基药物的含量测定，同时与药典结果进行对比，结果表明两种方法无显著性差异(表3)。甲巯咪唑、卡托普利和乙酰半胱氨酸的加样回收率分别为98.1%、97.4%和97.1%。表3 3种含巯基药物的测定结果（略）
3 讨 论
本实验以甲巯咪唑为例对可能的化学发光机理进行了探讨。根据化学发光动力学曲线可知，高锰酸钾与乙二醛为快速化学发光反应，注射后4s内达到最大化学发光，发光强度为64，随后有一个200s拖尾峰；当把高锰酸钾注射到乙二醛与甲巯咪唑混合液中后，出峰时间不变，但化学发光强度增强到440，并且拖尾峰基本消失。说明体系发光体为同一物质，甲巯咪唑可以增强高锰酸钾与乙二醛的化学发光强度。
SUN等[12]报道在甲醛存在的时候，高锰酸钾可以与还原性物质发生氧化还原反应产生1O12O2(1Δ1gΔg)，单线态双分子氧基态进一步转变为三线态氧，同时在639nm产生化学发光。化学发光体系紫外谱图3A表明，高锰酸钾与乙二醛混合后发生氧化还原反应，这个过程中可能产生发光体1O2(1Δg)；谱图3B表明，甲巯咪唑与乙二醛混合后没有发生化学反应；谱图3C和3D表明，高锰酸钾与甲巯咪唑混合后发生氧化还原反应，可能释放能量并产生发光体1O2(1Δg)。
综上所述，高锰酸钾与乙二醛的可能化学发光机理如下：
KMnO4+H++乙二醛1O2(1Δg)+h3O+Mn(Ⅱ-Ⅲ)+产物
KMnO4+H++SCC1O2(1Δg)+h3O+Mn(Ⅱ-Ⅲ)+产物
21O2(1Δg)1O12O2(1Δ1gΔg)
1O12O2(1Δ1gΔg)3O2(3Σg)+hν
参考文献
[1]KUSMIEREK K， BALD E. Determination of N-acetylcysteine and thioglycolic acid in human urine [J]. Chromatographia， 2008， 67(1-2):23-29.
[2]LI YH， LI AC， SHI HH， et al. Determination of S-phenylmercapturic acid in human urine using an automated sample extraction and fast liquid chromatography-tandem mass spectrometric method [J]. Biomed Chromatogr， 2006， 20(6-7):597-604.
[3]WALLSCHLAGER D， LONDON J. Determination of methylated arsenic-sulfur compounds in groundwater [J]. Environ Sci Technol， 2008， 42(1):228-234.
[4]田益玲，贾英民，李慧静，等. 紫外分光光度法测定面粉中的巯基含量 [J]. 中国粮油学报， 2005， 20(4):125-128.
[5]PASHA C， NARAYANA B. Spectrophotometric determination of endosulfan using thionin and methylene blue as chromogenic reagents [J]. Bull Environ Contam Toxicol， 2008， 80(1):85-89.
[6]SUAREZ WT， MARCOLINO JR. LH， FATIBELLO-FILHO O， et al. Voltammetric determination of N-acetylcysteine using a carbon paste electrode modified with copper (Ⅱ) hexacyanoferrate (Ⅲ) [J]. Microchem J， 2006， 82(2):163-167.
[7]ZAKHARCHUK NF， BORISOVA NS， GUSELNIKOVA E， et al. Determination of thiols and disulfides in whole blood and its fractions by anodic stripping voltammetry and anodic stripping voltammetric titration [J]. Electroanalysis， 2006， 18(23):2343-2353.
[8]WASEEM A， YAQOOB M， NABI A. Flow-injection determination of cysteine in pharmaceuticals based on luminol-persulphate chemiluminescence detection [J]. Luminescence， 2008， 23(3):144-149.
[9]TAHA EA， HASSAN NY， ABDEL AAL F， et al. Fluorimetric determination of some sulfur containing compounds through complex formation with terbium (Tb+3) and uranium (U+3) [J]. J Fluoresc， 2007， 17(3):293-300.
[10]AG L， PE A-FARFAL C， YEZ-SEDEO P， et al. Electrochemical determination of homocysteine at a gold nanoparticle-modified electrode [J]. Talanta， 2007， 74(3):412-420.
[11]Q2(R1). Validation of analytical procedures: Text and methodology [S]. http://www.ich.org/cache/compo/276-254-1.html
[12]SUN HW， LI LQ， CHEN XY. Sensitized chemiluminescence determination of fluorouracil in pharmaceutical and biological fluids based on potassium permanganate oxidation in the presence of formaldehyde [J]. J Clin Lab Analysis， 2007， 21(4):213-219.