作者：来宝长，谭武红，安静，郑瑾，王一理
【摘要】 目的 选择理想的非特异性抗原封闭方法以适应基于免疫渗滤法的蛋白芯片制备。方法 以杆状病毒-昆虫表达系统制备的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白抗原为例，采用脱脂奶粉、小牛血清、牛血清白蛋白及不同组合等5种方法对非特异性抗原进行封闭，检测其在免疫渗滤实验中对消除非特异性染色的效果，寻找最佳封闭非特异性染色的方法。结果 经过多次重复试验，并以PBS代替血清作空白试验，结果显示，目前常用的先固相然后封闭的几种方法，其封闭效果的稳定性和重复性不佳，且空白对照易出现假阳性；同时发现使用脱脂奶粉做封闭剂封闭后，由于奶粉颗粒易堵塞NC膜的孔径，影响NC膜的渗滤速度；使用小牛血清做封闭剂封闭后，由于NC膜对小牛血清的吸附而产生背景，影响结果判读；而采用20g/L BSA先封闭后固相的方法，在实验中得到满意的结果。结论 先封闭后固相的方法，在免疫渗滤实验中对非特异性抗原封闭的效果理想、结果稳定、重复性好，为一种理想的新的封闭方法。
【关键词】 免疫渗滤法；非特异性染色封闭方法；人乳头瘤病毒16型(HPV16)
ChinaABSTRACT: Objective To select an optimal non-specific antigen blocking method by using immuno-infiltration assay so as to suit protein chip preparation. Methods Human papillomavirus type 16 L1 protein expressed by insect-baculovirus espressin system was incubated with skimmed milk powder， calf serum， bovine serum albumin (BSA) combinations of five kinds of methods to block the non-specific antigen. PBS was used as control. The effect of eliminating non-specific stain was detected by immuno-infiltration assay. Results After repeated tests， the results showed that the stability and repeatability of blocking effects were poor for the fixing up antigen first and then blocking method， and the blank control was prone to false positive. The infiltration rate of NC membrane would be affected by using skimmed milk powder as a blocking agent because the pore of NC membrane was easily plugged by milk powder particles. The use of calf serum as a blocking agent made it very difficult to determine the result because the calf serum absorbed by NC membrane produced the background; however， when 20g/L BSA was used to blocking before fixing up antibody， the results became satisfactory. Conclusion Fixing up antibody after blocking in immuno-infiltration assay showed that the blocking effect against non-specific antigen was satisfactory， stable and repeatable， indicating this method is a novel optimal blocking method compared with others.
KEY WORDS: immuno-infiltration; non-specific staining blocking method; human papillomavirus type 16
免疫渗滤法是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为载体进行快速免疫分析的方法[1]，它实际上属于快速斑点免疫结合分析方法(dot immuneobinding assay， DIBA)中的一种，即免疫斑点渗滤分析(dot immunofiltration assay， DIFA)。该法通常是将抗原/或抗体固定于载体上，抗体/或抗原与膜表面固定的配基进行反应。该法灵敏度高(可达ng水平)，操作简便、快速，不需特殊设备，目前在低密度蛋白芯片技术中应用最多，但其非特异性着色却是困惑应用者的最大问题[2]。本研究以人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1VLP为抗原，对消除免疫渗滤法检测相应抗体时的非特异性染色方法进行了探讨，获得了满意的结果。
1 材料与方法
1.1 材料
HPV16L1病毒样颗粒(VLP)、胶体金标记的羊抗人IgG抗体由西安联尔科技有限公司制备；硝酸纤维素膜(NC膜，孔径0.45μm)购自美国Hybond公司；待测血清标本来源于西安交通大学医学院第一附属医院(宫颈癌确诊患者40例，儿童血清10例)；即溶脱脂奶粉为黑龙江纽迪希亚营养制品有限公司产品；牛血清白蛋白(BSA)购自华美生物工程公司；商品化HPV抗体检测试剂盒购自加拿大Fulda Biomedical Inc；Tween 20购自美国Promaga公司；小牛血清购自杭州四季青生物材料工程公司。改良TBE洗涤液：Tris Base 54g、硼酸27.5g溶于500mL双蒸水中，加0.5mol/L EDTA-Na2 20mL，调至pH8.0，补双蒸水定容1000mL，加200mL 300g/L饱和硫酸铵[(NH4)2SO4]及40mL Tween 20和双蒸水480mL，充分混匀后使用。
1.2 蛋白定量
双缩脲法测定HPV抗原浓度，用生理盐水调整蛋白浓度为1g/L。将抗原分成两份，一份备用，一份直接应用微矩阵点样机。将HPV16抗原点样于NC膜上，以人IgG(2g/L)为阳性质控点，点间距为3mm，点样量为100mL，并作定位标记，自然风干待检 。
1.3 非特异性染色的封闭[3-5]
方法一：取抗原膜100份，浸入10g/L BSA＋0.5g/L Tween 20中，室温振摇封闭2h，取出50份室温风干；另外50份继续封闭4h后室温风干，待检。方法二：取抗原膜100份，浸入50g/L脱脂奶粉中，室温振摇封闭2h；取出50份，PBS漂洗2min，室温风干；4h后取另外50份，PBS漂洗2min，室温风干，待检。方法三：取抗原膜100份，浸入50g/L BSA＋10g/L脱脂奶粉中，室温振摇封闭2h；取出50份，PBS漂洗2min，室温风干；4h后取另外50份，PBS漂洗2min，室温风干，待检。方法四：取抗原膜100份，浸入100mL小牛血清中，37℃封闭2h；取出50份室温风干，另外50份直接进行免疫渗滤检测。方法五：取 HPV16L1VLP(1mg/mL)50μL与等体积20g/L BSA混合，4℃过夜，按上述点样方法点样，待检。
1.4 免疫渗滤实验
参照文献[6-7]将干燥的抗原膜片(点样面朝上)装入塑料渗滤夹具中，在待检膜下衬垫吸水材料，压紧渗滤夹，依次加洗涤液2滴，血清标本50μL，洗涤液2滴，适度稀释的胶体金标记羊抗人IgG抗体2滴。每步间隔时间为所加试剂完全渗入后再进行下一步。最后加洗涤液2滴，洗去未结合的胶体金。以PBS代替血清作空白对照。结果观察：在膜中央出现红色斑点者为阳性，颜色稍浅者为弱阳性，否则为阴性。其下方的质控对照点为实验有效的标志，无论阳性或阴性结果，对照线均应显示红色。
2 结 果
以脱脂奶粉、BSA、Tween 20及小牛血清为封闭剂，以不同方法进行封闭，检测50例相同的血清标本，每种封闭方法重复试验5次，并以PBS代替血清作空白试验。结果显示，前4种先固相后封闭的方法，其结果的稳定性和重复性受到封闭温度、时间及封闭剂浓度等因素变化的影响，且空白对照易出现假阳性；第2种和第3种加入脱脂奶粉的封闭方法，封闭后由于奶粉颗粒易堵塞NC膜的微孔，影响渗滤速度；小牛血清做封闭剂则由于NC膜对小牛血清的非特异吸附而产生背景，影响结果判读。而采用20g/L BSA先与抗原共育后再点膜的方法，其封闭效果理想、结果稳定、重复性好，为一种理想的新的封闭策略。
2.1 封闭效果检验
分别用免疫渗滤试验(先封闭后固相的封闭方法)和商品化HPV抗体检测试剂盒(按试剂盒说明书进行)检测40例宫颈癌患者血清和10例儿童血清，结果显示，免疫渗滤试验的灵敏度[82.5%(33/40)]和特异度[90%(9/10)]与商品化HPV抗体检测试剂盒的灵敏度[85%(34/40)]和特异度[80%(8/10)]，经Fisher确切概率法检验差异无统计学意义(P>0.05，表1)。表1 免疫渗滤法与商品化试剂盒检测HPV抗血清的结果比较（略）两种不同方法检测结果比较，P>0.05(Fisher确切概率法)。
2.2 特异性阻断吸附试验
随机抽取5份阳性患者血清，各取50μＬ分别加入等量的包被抗原，混匀，4℃过夜，10000r/min离心30s，同时用商品化抗HPV16L1抗体与抗原VLP共育后点膜，再行免疫检测，结果均为阴性。而用 20g/L BSA行相同处理后，检测结果为阳性。
2.3 敏感性试验
随机抽取5份阳性血清，用生理盐水按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5稀释，混匀后各取50μL进行免疫渗滤法检测，结果显示在1∶4稀释的血清标本仍出现弱阳性。
2.4 稳定性和重复性试验
将第5种封闭方法制备的抗原膜片置37℃温箱2d和室温保存30d，与放置4℃的抗原膜片对照检测阳性血清和阴性血清，分批先后作5次试验，均获得相同结果。
3 讨 论
免疫反应是以其高度特异性为特征，利用免疫反应的特异性和敏感性已建立了许多临床检测方法。随着临床检测所需样品的微量化，检测过程/结果判读的快速化，如何保证结果的特异性就成为最受关注的问题。以往在免疫细胞/组织化学/蛋白印迹染色过程中对消除非特异性染色已有较多的报道，且积累了丰富的经验。在这些实验中，可以同时兼顾“速度”和“特异性”，为了最大程度获得特异性，可以多重/长时间处理以消除非特异性着色。但对于临床检测，特别是近年来以硝酸纤维素膜为载体的快速免疫分析，除准确性外，速度成为设计中最关键的参数。如何在基于硝酸纤维素膜为载体的快速斑点免疫渗滤分析的蛋白芯片制备过程中同时兼顾快速和特异性，是这一技术的关键[8]。目前最常用的非特异性染色消除方法是先在载体膜上进行点样，然后应用BSA或脱脂奶粉结合Tween 20、Tween 80、Triton X-100等进行封闭。工作中发现，这些方法虽然有一定的效果，但在封闭后的稳定性、重复性及抗原保存上仍不够理想[9]。本实验选择5种不同的封闭方法，结果发现以先点膜固相后再封闭，均不能得到理想的效果，而将1g/L的抗原与等体积的20g/L BSA预先混合，4℃共育过夜，然后固相于NC膜上，其封闭效果极佳，避免了BSA的浪费，点样后的抗原膜室温保存30d以上仍很稳定，且操作方便、灵敏度高、结果可靠。分析与对照实验出现误差的原因，可能是由于抗原的浓度不同而灵敏度也不同，以及与所选用硝酸纤维素膜的性能和质量、膜孔径大小和均一性不同有关。这些问题有待于进一步研究。
参考文献
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