CEECL法同时测定复方磷酸可待因中三种成分的方法学研究

　　　　作者：李海燕，木合塔尔·吐尔洪，唐玉海，张广彬

【摘要】 目的 建立毛细管电泳电化学发光法分离并检测复方磷酸可待因中三种成分，磷酸可待因、马来酸溴苯那敏和盐酸麻黄碱含量的新方法。方法 基于碱性介质中，复方磷酸可待因溶液中三种主要成分对联吡啶钌在铂电极上的电化学发光信号的增敏作用，且增敏强度和药物浓度成线性关系，与毛细管电泳联用，建立了毛细管电泳电化学发光法分离并检测其含量的新方法。结果 在优化的实验条件下，确定三种药物对照品的线性范围、线性方程和检出限。通过对浓度为1.0×10-5kg/L的磷酸可待因、马来酸溴苯那敏和盐酸麻黄碱对照品进行12次平行测定，其ECL发光强度的RSD值分别为2.89%，3.76%，3.32%。结论 该方法可用于复方磷酸可待因口服溶液中三种主要成分的含量测定，待测样品中的基质不干扰测定，方法的回收率分别为100.4%，101.9%，99.8%(n=5)。

【关键词】 毛细管电泳；电化学发光；磷酸可待因；马来酸溴苯那敏；盐酸麻黄碱

　　ABSTRACT: Objective To establish a novel method for simultaneous determination of three ingredients (codeine phosphate， brompheniramine maleate and ephedrine hydrochloride) in compound codeine phosphate solution by using capillary electrophoresis (CE) coupled with electrochemiluminescence (ECL). Methods Based on enhanced ECL intensity of tris (2，2′bypyridine) ruthenium (Ⅱ) with codeine phosphate， brompheniramine maleate and ephedrine hydrochloride， as well as the linear correlation between enhanced sensitivity intensity and drug concentration， platinum disk (300μm in diameter) was used as a working electrode. Parameters affecting separation and detection were optimized. Results Under the optimized conditions， we determined the linear range， regression equation and detection limit for the three ingredients. The relative standard deviation of ECL intensity for twelve consecutive injections of 1.0×10-5kg/L standard sample of three kinds of drug was 2.89% for codeine phosphate， 3.76% for brompheniramine maleate and 3.32% for ephedrine hydrochloride， respectively. Satisfactory results were obtained without interference from sample matrixes. Conclusion The method was successfully applied to the determination of three ingredients in oral solution of compound codeine phosphate， with the recovery rate of 100.4% for codeine phosphate， 101.9% for brompheniramine maleate and 99.8% for ephedrine hydrochloride.

　　KEY WORDS: capillary electrophoresis; electrochemiluminescence; codeine phosphate; brompheniramine maleate; ephedrina hydrochloridum

　　复方磷酸可待因口服溶液具有镇咳祛痰，抗过敏，治疗伤风，流感之功效。其中主要成分为磷酸可待因、盐酸麻黄碱、马来酸溴苯那敏、愈创木酚甘油醚和辅料，成分较为复杂，在一般检测方法中相互干扰和影响。文献中已报道的磷酸可待因的含量测定方法有非水滴定法，酸碱滴定法[1]；盐酸麻黄碱的含量测定方法有非水滴定法，分光光度法[1]；马来酸溴苯那敏的含量测定方法有非水滴定法[1]，分光光度法[12]，高效液相色谱法[34]，电化学发光法[5]。这些方法都有其不足之处，如混合样品中各成分很难同时检测。本文依据三种待测药物磷酸可待因、盐酸麻黄碱和马来酸溴苯那敏的结构(图1)中的胺基与电化学发光(electrochemiluminescence)试剂联吡啶钌配合物Ru(bpy)2+3发生的电化学发光反应，建立了对其进行含量测定的新方法。
　　
　　毛细管电泳(capillary electrophoresis)已成为一种重要的分离技术。在分析科学尤其是生命科学及临床医学中起着很重要的作用[6]。在电化学发光体系中，电化学发光试剂联吡啶钌配合物Ru(bpy)2+3已被成功地用于免疫分析、DNA分析、药物分析和机理的研究等诸多领域[78]。把毛细管电泳与电化学发光分析法有机结合起来，可以将毛细管电泳的高分离能力与电化学发光高灵敏度检测优点相结合[911]。CEECL联用同时测定复方磷酸可待因口服溶液所含多种混合物中三种药物含量的方法未见报道。本文建立的新方法对于科学准确地控制和管理麻醉及精神药品起到了很好的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　MPIA型毛细管电泳电化学发光检测器(西安瑞迈电子科技有限公司)。pHs2C型酸度计(上海华侨仪器厂)。KQ218超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。毛细管长50cm、内径为25μm (河北永年光导纤维厂)。联吡啶钌(Sigma公司)储备液0.1mol/L：取联吡啶钌约2.0g，精密称定至1.8715g，用二次蒸馏水稀释并定容至25mL，即得100mmol/L的储备液，使用前逐级稀释至所需浓度。用Na2HPO4和Nah3PO4(西安化学试剂厂)配制一系列pH值的磷酸盐缓冲液。实验中所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。实验中所有进入毛细管的溶液须用0.22μm醋酸纤维素膜过滤。
　　
　　磷酸可待因和盐酸麻黄碱对照品均由中国药品生物制品检定所提供，纯度分别为99.8%和99.7%。马来酸溴苯那敏原料药执行企业内控质量标准，由沈阳新地药业有限公司提供，含量在98.5%以上(国药准字h30052113)。复方磷酸可待因口服溶液购自香港澳美制药厂。批号：0706302，0803302，0804302；规格：每5mL样品中含有磷酸可待因4.5mg，马来酸溴苯那敏2.0mg，盐酸麻黄碱5.0mg和愈创木酚甘油醚。

　　1.2 实验方法

　　混合对照品溶液的配制：准确称取经105℃干燥至恒重的磷酸可待因、盐酸麻黄碱、马来酸溴苯那敏对照品分别约为45，50，20mg，置50mL量瓶中，用二次蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1mL，置10mL量瓶中，用二次蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。用0.22μm醋酸纤维素膜过滤，取过滤液进行测定。用前逐级稀释至所需浓度。

　　样品溶液的配制：取复方磷酸可待因口服溶液1mL，置10mL容量瓶中，用二次蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，再用0.22μm醋酸纤维素膜过滤，取过滤液进行测定。
　　
　　毛细管的预处理与检测池的安装：将未涂层的新毛细管使用前依次用1mol/L NaOH溶液在60℃冲洗30min，使毛细管内壁生成硅醇基，再依次用0.1mol/L NaOH溶液、二次蒸馏水、运行缓冲液各冲洗10min。每次使用前毛细管分别以NaOH溶液、二次蒸馏水、磷酸盐缓冲液各冲洗5min。两次进样中间可仅用缓冲液冲洗。

　　2 结果

　　2.1 分离条件的优化
　　
　　分离高压对ECL光强的影响： 当毛细管两端所加分离高压在3～19kV范围内变化时，发现当其高于15kV时，基线噪音变得明显，可能是由于较大的分离电压使毛细管内焦耳热效应增加，峰形变差。另一方面，参照进样体积公式[12]：Vi=Ei ×ti ×Vcapillary/Es×tm，Ei表示进样电压，Es表示分离电压，ti表示进样时间，tm表示分析物的迁移时间，Vcapillary表示毛细管的体积。可看出随着分离高压的增大，进样量的减少可能导致发光效率的降低。实验中采用15kV作为分离电压。
　　
　　运行缓冲液的浓度及pH值对ECL光强的影响： 因运行缓冲液的pH值影响分离中的电渗流大小和分析物所带电荷，从而影响其分离效果。实验中考察了20mmol/L pH值5.0～9.5范围内磷酸盐缓冲液对ECL光强的影响，发现当pH值为7.16时发光强度达到最大，而后ECL光强随着pH值的增大而减小。固定运行缓冲溶液pH值到7.16，考察了磷酸盐缓冲液浓度在10～50mmol/L范围内变化时ECL光强的变化，当浓度大于30mmol/L时，ECL光强有所降低，可能是因为离子强度的增加导致焦耳热效应的增加。故在实验中选择pH值为7.16的20mmol/L的运行缓冲液。
　　
　　进样高压和进样时间对ECL光强的影响： 仪器采用自动电迁移进样，按2.1中公式，对于特定分析物和毛细管，电动进样体积决定于进样时间ti，进样电压Ei和分离电压Es。其毛细管柱效按以下公式评价[1]：N=5.54(tm/W0.5h)2，N表示理论塔板数，tm是迁移时间，W0.5h表示半峰宽。在考察进样时间对ECL光强的影响时发现当其在3～19s变化时，在10s时ECL光强达到最大。因此选择进样时间为10s。当进样高压在3～19kV范围内变化时，随着进样高压的增加，ECL光强增强但是柱效降低。在进样高压达到15kV之后，电泳峰开始变宽，因此选择进样电压为15kV。电化学发光反应是在工作电极表面发生。因此，ECL光强依赖于工作电极表面扩散层分析物的浓度，在高的进样电压下，较多的分析物进入扩散层，产生较强的ECL光强。然而，当进样量过大时，分析物的散布导致峰展宽，柱效降低。综合各因素，将进样时间和进样电压确定为10s，15kV。

　　2.2 检测条件的优化

　　2.2.1 检测电位对ECL光强的影响

　　施加在电极上的电压引发化学发光反应，从而影响其ECL发光强度。因此，检测电位应至少高于发光试剂的氧化电位，以使其生成Ru(bpy)3+3。当检测电位在小于1.10V时，光信号为零。在1.10～1.30V范围内变化时，发光强度随着检测电位的增加而增加，当检测电位为1.22V时，发光强度达到最大，而后随着检测电位的增加而减小，故选择1.22V为检测电位。

　　2.2.2 检测池中溶液浓度及其pH值对ECL光强的影响

　　检测池中联吡啶钌及磷酸盐缓冲液的浓度、pH值对发光强度有影响。实验研究了3～50mmol/L联吡啶钌浓度的变化对ECL光强的影响，发现当联吡啶钌的浓度为5mmol/L时可以得到较大的ECL光强，当其浓度大于5mmol/L时基线开始漂移，选取其浓度为5mmol/L。当磷酸盐缓冲液浓度为50mmol/L时有较大的ECL光强，故选择检测池中钌联吡啶的浓度为5mmol/L，磷酸缓冲溶液浓度为50mmol/L。
　　
　　联吡啶钌在弱碱性溶液中有较强的化学发光强度。当磷酸盐缓冲液的pH值在4.5～9.5范围内变化时，三种药物的ECL光强也随之显著变化，当pH值为8.5时光强达到最高峰，故选择检测池中缓冲液的pH值为8.5。

　　2.3 方法学考察

　　2.3.1 方法回收率

　　按处方比例，取三种主药成分及各种辅料配制成样品后，测定三种组分的回收率。磷酸可待因、盐酸麻黄碱、马来酸溴苯那敏的平均回收率分别为100.4 %，99.8%，101.9%；相对标准偏差(relative standard deviation， RSD)分别为2.2%，1.9%，3.1%(n=5)。结果表明，三种组分的回收率均较好，RSD较小，说明该分析方法是准确可靠的。

　　2.3.2 线性范围

　　以时间t(s)为横坐标，以ECL光强为纵坐标记录1.2项下混合对照品溶液的电泳图(图2)。根据处方的比例，将三种主药成分配制成一系列不同浓度的混合对照品溶液，依次进行毛细管电泳电化学发光分析，确定方法学考察各参数(表1)。

　　2.3.3 配制溶液的稳定性实验

　　在本实验条件下，配制溶液具有较好的稳定性，同一溶液连续3d内分别进样(n=12)。可待因ECL光强峰日内RSD为2.89%，日间RSD为3.01%；麻黄碱ECL光强峰日内RSD为3.32%，日间RSD为4.22%；马来酸溴苯那敏峰ECL光强峰日内RSD为3.76%，日间RSD为4.73%。表1 复方磷酸可待因溶液中三种化合物的线性范围、回归方程及检测限（略）

　　2.3.4 空白辅料及其他成分的干扰实验

　　按处方比例配制除去三种主药以外的空白溶液，用与含量测定项下相同的方法处理样品，得到一空白供试品溶液。在本实验条件下进样，得到该空白供试液电泳图基本为一条无明显峰的直线，说明其他组分都没有电化学发光信号，不干扰三种药物的含量测定。
　　
　　配制与处方浓度相当的愈创木酚甘油醚溶液。在本实验条件下进样，得到该溶液电泳图基本为一条无明显峰的直线，说明其没有电化学发光信号，不干扰三种药物的含量测定。

　　2.4 三种药物发光机理的探讨

　　体系中存在的三种待测药物具有一定还原性，当对电极施加一个合适的氧化电位时，Ru(bpy)2+3被氧化成为Ru(bpy)3+3，同时三种待测药物也在电极上被氧化，并进一步生成还原型产物。该产物与Ru(bpy)3+3发生氧化还原反应，产生激发态的Ru(bpy)2+3*，Ru(bpy)2+3*返回基态时释放出光子，其氧化还原型电化学发光反应可能机理是(Analyte 表示三种待分析物)：

　　Ru(bpy)2+3eRu(bpy)3+3(氧化)

　　AnalyteeAnalyte·+(氧化)

　　Analyte·+Analyte·+H+(脱质子)

　　Analyte·+Ru(bpy)3+3Ru(bpy)2+*3+products(电子转移)

　　Ru(bpy)2+*3Ru(bpy)2+3+hv(发光)

　　2.5 口服溶液剂中三种药物的含量测定

　　用所建立的方法，按1.2项下样品溶液配制方法对厂家生产的三批样品进行测定(表2)。表2 复方磷酸可待因口服溶液含量测定的结果（略）

　　3 结论
　　
　　复方磷酸可待因口服溶液为一典型的复方制剂，药典中对其含量测定方法尚无明确规定。本文建立了以毛细管电泳进行分离，电化学发光检测器进行检测的新方法。结果表明，该分析方法的精密度、准确度都比较好，检出限低，灵敏度高，并且操作较简便、快捷，一次进样即可得到三种组分的含量测定结果，便于在实际生产、检验中应用。

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