α1AAR阻滞剂对HRS大鼠肾淤血的保护作用及其机制

　　　　作者：张晓刚，贺建宇，万真，李翔，曹永孝，吕毅 张晓刚

【摘要】 目的 研究α1A肾上腺素受体(α1AAR)阻滞剂—盐酸坦索罗辛(Tamsulosin)对肝性功能性肾衰竭(HRS)大鼠肾淤血的保护作用及其机制。方法 应用D(+)氨基半乳糖盐酸盐[D(+)Galactosamine hydrochloride(GalN)]复制肝性功能性肾衰竭大鼠模型。将建模成功大鼠随机分组，行下腔静脉阻断(OIVC)实验，并给予高选择性α1AAR阻滞剂坦索罗辛术前干预。各组动物分别于下腔静脉阻断前和复流后24h取血测定血清肝肾功生化指标，激光多普勒血流监测仪记录肾皮质和髓质的血流量变化；同时切取肝、肾组织，行HE染色及免疫组化染色，扫描电镜观察肾脏的超微结构。结果 HRS大鼠在经历下腔静脉阻断术后，肾皮质、髓质血流明显下降，且较正常大鼠不易恢复，术后肾功明显损伤。坦索罗辛干预大鼠下腔静脉阻断后肾脏淤血改善较明显，肾脏及肾动脉组织α1AR表达均明显降低，病理改变程度较轻。结论 经历缺血应激损伤后，HRS大鼠可能由于α1AR高表达所导致的血管收缩反应性增强而容易发生急性肾衰竭。高选择性α1AAR阻滞剂坦索罗辛可显著下调肾动脉及肾小管α1AAR过表达，对HRS大鼠肾脏淤血起到保护作用。

【关键词】 肝性功能性肾衰竭；缺血性损伤；坦索罗辛

　　ABSTRACT: Objective To study the mechanism of the protective effect of α1AAR antagonist Tamsulosin (Tam) on renal ischemic injury in hepatorenal syndrome (HRS) rats. Methods HRS was induced in male SpragueDawley (SD) rats by intraperitoneal injection of D(+)galactosamine hydrochloride (GalN). Thirtytwo HRS rats were pided into 3 groups randomly. Then surgical occlusions of the infrahepatic inferior vena cave (OIVC) were performed; Tam， an α1AAR antagonist， was administered daily before injection of GalN. During the operation， hemodynamic changes of the kidney and liver were measured by laser Doppler flowmetry (LDF). Serum samples were collected to measure serum levels of liver and renal function. At the same time， renal and liver samples were harvested and stained by HE and immunohistochemistry. Other parts of the sample were fixed with 2.5% glutaral to observe the cellular ultrastructure of renal and vascular endothelium by electron microscope. Results OIVC developed much severe ischemic injury in the kidney and liver of HRS rats. The renal cortex blood perfusion (RCBP) of HRS rats decreased rapidly after OIVC， and did not return to baseline after reflow. Pathological study showed severe injury of the liver and kidney. However， expressions of alpha1 AR on renal artery and kidney were reduced in those rats that had received Tam before OIVC. Histological examination of the kidney also showed few abnormalities. Conclusion Marked increases of contractive response of renal artery of HRS rats induced by upregulation of α1AR may be associated with a high risk of progression to acute renal failure in HRS rats after ischemia. Tamsulosin has a protective effect on renal ischemic injury through reducing α1AAR overexpression in HRS rats.

　　KEY WORDS: hepatorenal syndrome; ischemic injury; Tamsulosin

　　肝性功能性肾衰竭又称肝肾综合征(hepatorenal syndrome， HRS)，是指继发于急、慢性重症肝病患者的功能性肾衰竭，死亡率高达80%～100%[13]。其病理特点为肾血管收缩和轻度体循环低血压，但肾脏病理检查无明显器质性病变。原位肝移植术是目前唯一有希望提高HRS生存率，使患者痊愈的治疗措施，但由于手术时间相对较长，术中须经历无肝期，下腔静脉需要完全或部分阻断，导致病变肾脏淤血加重，尤其对于合并HRS的患者，更易诱发术后急性肾功能衰竭的发生[4]。因此，我们亟需筛选出能高选择性作用于肾脏血管的血管活性药物，以期对 HRS患者在肝移植后肝肾功能恢复阶段起到积极作用。
　　
　　本研究首先观察HRS大鼠在经历下腔静脉阻断术后的肾损伤特点及恢复情况，进一步研究高选择性肾上腺素受体(α1AAR)阻滞剂坦索罗辛在HRS大鼠经历下腔静脉阻断时，对于肾血管功能、肾血流量以及肾功能的恢复和保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要实验试剂

　　受体抑制剂：盐酸坦索罗辛购自山之内制药(中国)有限公司，自制0.015mg/mL(10g/L羧甲基纤维素钠)灌胃液；抗体：alpha 1 Adrenergic Receptor Antibody购自abcam公司；D(+)氨基半乳糖盐酸盐[D(+)Galactosamine hydrochloride(GalN)]购自南京德赛生物技术有限公司。

　　1.2 主要实验仪器

　　手术显微器械(上海医疗器械公司)；全自动生化分析仪(HITACHI日立7600)；血气分析仪(AVL995，瑞士)；激光多普勒血流监测仪(瑞典百灵威，Perimed AB公司生产，型号：FeriFlux System 5000)；凝胶成像分析系统(Cold Spring)；紫外扫描分析仪(Kodak Digital Science1 D 2.0， Kodak)；HITCH600透射电镜(日立)。

　　1.3 动物模型的建立

　　1.3.1 动物饲养

　　雄性清洁级近交系封闭群SD大鼠，体重200～250g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，药理研究所动物饲养室代谢笼饲养。恒温(22±3)℃，恒湿(55±5)%，24h自由取食和饮水，饲料由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.3.2 实验分组

　　A组(正常对照组，n=10)：腹腔注射生理盐水2mL/只；B组(GalN组，n=10)：腹腔注射GalN 1200mg/kg；C组(下腔静脉阻断组，n=10)；D组(GalN＋下腔静脉阻断组，n=12)；E组(GalN＋坦索罗辛＋下腔静脉阻断组，n=10)；F组(GalN+溶媒对照SCMC+下腔静脉阻断组，n=10)。

　　1.3.3 建模方式

　　D、E、F组动物在注射GalN后48h，应用20g/L戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射，麻醉成功后纵行开腹，游离下腔静脉肝下段，于右肾静脉平面以上，以无损伤血管夹完全阻断下腔静脉60min后开放，至复流后30min逐层关腹，待麻醉苏醒后自由饮食。E组和F组动物在下腔静脉阻断前6h称体重，按0.03mg/kg进行坦索罗辛灌胃或溶媒制剂(SCMC)灌胃，术后按0.03mg/(kg·d)继续灌胃。C组大鼠腹腔注射2mL生理盐水48h后行下腔静脉阻断术。

　　1.4 激光多普勒血流监测

　　测量指标为：①PU：为LDF测量的基本指标，即流动的RBC产生的多普勒位移值，是一个表示测量深度内局部组织微循环血流量大小的相对单位，PU值的变化直接反应了组织微循环血流量的改变。②移动红细胞密度(concentration of moving blood cells， CMBC)：表示测量范围内的RBC密度。③速度(V)：为血液流速指标，表示测量范围内的平均RBC流速。

　　1.4.1 肾皮质血流监测

　　D、E、F组动物待注射GalN 48h后，应用20g/L戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射，麻醉成功后纵行开腹，充分暴露左侧肾脏，保持测定区域恒定不动。将光纤探头用支架垂直固定于肾脏表面。调整血流仪增益为1，最大上限频率12kz，探头尖端激光输出功率为1mW，校准值为(250±15)PU，调零值为(0±0.5)PU。测量血流前，术野和探头以9g/L生理盐水浸润，选择被测区域为肾门外下2mm处，每次测量连续记录3min。先测量记录自然状态下各实验组动物肾皮质血流量，然后行下腔静脉阻断术，选取阻断后5、15、30、45、60min分别记录肾皮质血流量变化；同样，在解除下腔静脉阻断后，选取复流后5、15、30min记录不同时间点肾皮质血流量变化，将记录的数据通过Perisoft程序处理。

　　1.4.2 肾脏髓质血流监测

　　调整光纤探头垂直穿过肾皮质，进入髓质。其余测量方法与数据分析与肾皮质血流监测相同。

　　1.5 生化指标检测

　　血浆转氨酶ALT、AST、总胆红素、尿素氮、血肌酐和尿肌酐结果均来自HITACHI7600010型全自动生化仪。钠离子测定通过AVL995血气分析仪。肌酐清除率(CCr)：尿肌酐(mg/dL)×每分钟尿量(mL/min)/血肌酐(mg/dL)。钠排泄分数(FENa)：(尿钠/血钠)/(尿肌酐/血肌酐)×100%。自由水清除率(Ch3O)：每分钟尿量×(1-Uosm/Sosm)。

　　1.6 组织形态学观察

　　1.6.1 透射电镜观察

　　切取1mm3肾脏组织及肾动脉标本取，置于25mL/L的戊二醛固定液中4℃固定2h以上(固定液内含有0.1mmol/L磷酸缓冲液、40g/L多聚甲醛)，透射式电子显微镜下观察、拍照。

　　1.6.2 组织病理学检测及免疫组化染色

　　切取5mm×5mm×5mm肝脏及肾脏组织，浸入100g/L中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，行HE染色及免疫组化病理学检测。

　　1.7 统计学处理

　　统计学处理应用SPSS11.5统计软件完成。所有定量资料数据用均数±标准差(±s)表示，两组间差异采用t′检验，多组间两两比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。结果中图表应用Graph Pad Prism 绘图分析统计软件绘制。

　　2 结 果

　　2.1 一般情况

　　A组大鼠全部存活，存活率100%，平均尿量为(15.9±2.04)mL。B组所有大鼠于注射GalN 12h内一般情况较对照组大鼠无明显差异；12h后，B组大鼠活动明显减少，嗜睡，不思饮食，并逐渐进入嗜睡状态，有时呈激惹状态，部分伴尿失禁，尿色深黄，平均尿量为(8.1±1.55)mL。C组术后全部存活，存活率100%，饮食及尿量未受明显影响。D组有1例大鼠在麻醉恢复期死亡，1例在术后24h死亡；术后尿量明显减少，与术前比较差异有统计学意义[(6.0±0.8)mL/d vs. (8.5±1.5)mL/d，P<0.05]。E组术后全部存活，存活率100%；尿量与术前比较差异有统计学意义[(7.4±1.0)mL/d vs. (8.57±1.3)mL/d，P<0.05]；与D组术后比较有上升趋势，但无统计学差异[(7.4±1.0)mL/d vs. (6.0±0.8)mL/d，P>0.05]。F组术后全部存活，存活率100%；术后尿量明显减少，与术前比较有统计学差异[(7.0±0.5)mL/d vs. (8.7±1.2)mL/d，P<0.05)；与D组和E组术后比较，无统计学差异(P>0.05)。

　　2.2 肾功能指标的比较

　　①C组：和A组比较，术后肾功有所损伤，但血清BUN水平变化无统计学差异(P>0.05，表1)。②D组：术后肾功和B组比较，各项指标均提示明显损伤(表2)。③E组：术后肾功与B组相较，除CCr外各项指标均提示损伤表现，具有统计学差异；与D组比较，Ch3O、UNa和FENa等反映肾小管功能指标有所改善。血清BUN水平有所降低，具有统计学差异；CCr变化虽无显著意义，但有上升趋势(表2)。④F组：术后肾功与B组相较，各项指标均提示损伤表现，具有统计学差异；与D组比较，除UNa和UCr外各指标均无显著变化(表2)。表1 下腔静脉阻断对正常大鼠肾功的影响（略）表2 坦索罗辛对肝肾综合征大鼠经历下腔静脉阻断后肾功变化的影响（略）

　　2.3 光镜下的组织形态学变化

　　2.3.1 肝脏

　　A组肝细胞排列整齐，结构完整(图1A)；B组肝脏出现肝细胞坏死和炎细胞浸润，小叶结构破坏(图1B)；D组在经历下腔静脉阻断术后，可见肝细胞坏死，伴有炎性细胞浸润和枯否细胞增生活跃，肝窦扩张、充血(图1C)；E组和F组肝脏组织与D组镜下表现无明显区别。

　　2.3.2 肾脏

　　C组肾小球未发现明显病理改变，肾小管明显肿胀(图1D)。D组未见明显肾小球病变，肾小管病变以皮髓交界处和皮质部较重，髓质部次之；同一区域肾小管上皮细胞病变程度也不一致，可见肾小管上多个上皮细胞坏死，细胞质空泡变性，胞质浓缩，嗜酸性增强，核固缩、核碎裂、核溶解同时存在(图1E)。E组肾脏绝大多数只表现为少数肾小管上皮细胞变性，部分有刷状缘脱落，偶见肾小管上皮细胞坏死。未见肾小管腔内细胞碎片和管型(图1F)。F组镜下表现和D组相同。

　　2.4 电镜下的超微结构变化

　　2.4.1 肾脏

　　A组可见肾小球结构基本正常，肾小管上皮细胞排列基本整齐，细胞核圆形或椭圆形，核内染色质分布均匀，异染色质沿核膜分布(图2A)。D组可见肾小球未发现明显病理改变，肾小管上皮细胞电子密度不均，亮细胞及暗细胞交叉排列，细胞质内线粒体明显肿胀(图2B)。E组肾小球未发现明显病理改变，肾小管上皮细胞排列基本整齐， 线粒体未见明显肿胀(图2C)。

　　2.4.2 肾动脉

　　A组肾动脉组织血管内皮细胞多数正常，细胞呈扁平状，紧贴于内弹力膜(图2D)。D组肾动脉组织血管内皮细胞肿胀、脱落，内弹力膜裸露、断裂，细胞内线粒体肿胀、嵴消失，粗面内质网扩张，细胞的电子密度降低(图2E)。E组肾动脉可见部分内皮细胞与内弹力膜连接疏松，偶有脱落，但内弹力膜结构完整(图2F)。

　　2.5 α1AR的免疫组化染色

　　α1AR的染色阳性信号为棕色颗粒，定位于远曲和近曲肾小管细胞、肾血管内皮细胞。C组肾小管细胞胞质内可见分布均匀、稀疏的浅棕色颗粒，呈弱阳性表达；D和F组肾小管细胞及肾血管内皮细胞内可见浓密的深棕色颗粒，呈强阳性表达(图3)；而E组肾组织内α1AR几乎不表达(图4)。

　　2.6 激光多普勒血流监测结果

　　2.6.1 肾脏皮质血流监测结果

　　①A组的肾皮质血灌流量(renal cortex blood perfusion， RCBP)平均基线值是(438.29±41.70)PU，而B组在注射GalN 48h后，平均RCBP下降至(38.92±16.87)PU，与基线的百分比变化值为-74.37%，与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)。②C组RCBP平均基线值是(416.11±28.24)PU；下腔静脉阻断初始 RCBP迅速下降，下腔静脉复流后，RCBP迅速增高，以后 RCBP 逐渐增高，至复流后30min接近基线水平(412.39±30.81)PU，百分比变化值为-0.89%(图5)。③D组RCBP平均基线值是(226.07±42.55)PU；下腔静脉阻断初始RCBP迅速下降且幅度较大，下腔静脉复流后，RCBP缓慢增高且幅度较小，至复流后30min仍显著低于基线水平[(179.38±77.69)PU，P<0.05]，百分比变化值为-20.80%(图5)。④E组RCBP平均基线值是(225.17±37.27)PU，与D组基线水平无统计学差异，但显著低于B组基线水平；下腔静脉阻断初始RCBP迅速下降，下腔静脉复流时，RCBP迅速增高，复流后30min达到基线水平[(229.97±97.67)PU，百分比变化值为+2.22%)(图5)。⑤F组RCBP平均基线值是(241.46±16.96)PU，与D、E组基线水平无统计学差异，但显著低于B组基线水平；下腔静脉阻断初始RCBP迅速下降，下腔静脉复流时，RCBP缓慢增高，复流后30min仍显著低于基线水平[(158.65±46.48)PU，P<0.05]，百分比变化值为-34.02%(图5)。

　　2.6.2 肾脏髓质血流监测结果

　　各组肾脏髓质血流监测与肾皮质血流变化趋势相同(图6)。

　　3 讨 论

　　由于原位肝移植手术创伤大，术中经历门腔静脉阻断和开放，引起血流动力学的波动、凝血功能异常等使肾小球滤过率进一步下降，进一步加重肾功能损害，大量病例术后出现急性器质性肾功能衰竭。因此，肾功能的保护是HRS肝移植亟需解决的难题之一。有研究报道，HRS患者肝移植围手术期肾功能不全的发生率为40%～70%，要远高于普通重大手术平均的围手术期肾功能不全发生率(10%～30%)。因此，术前合并肝肾综合征，是肝移植术后肾功能衰竭的危险因素之一。了解不同肾功储备对于缺血应激损伤的耐受性及预后恢复规律，将对临床肝移植无肝期肾损伤的研究具有重要意义[56]。
　　
　　本研究所观察到的正常大鼠与HRS大鼠经历OIVC术后的不同表现，一方面说明肾脏储备功能强大，肾静脉侧枝循环可充分回流减轻肾脏淤血，以及肾小管损伤具有可代偿性；另一方面提示HRS大鼠在经历肾静脉淤血以及低灌注压的打击后，极易出现急性肾衰竭表现，主要表现为肾皮质的缺血加重以及肾小管损伤加重。因此，在原位肝移植术中不但要缩短门静脉阻断时间，同时也要尽可能缩短下腔静脉阻断时间。影响临床肝移植术后肾功能的因素是多方面的，术前肾功能、心脏功能及凝血功能、术中出血量及血液动力学情况、术后肾毒性药物的应用等都起着重要作用。因此，对于合并HRS的患者，更要注意在术后围手术期对肾功能的保护，应防止多因素协同对尚处于功能性肾衰竭的患者造成新的损伤，导致器质性肾功衰竭[78]。
　　
　　本实验中，HRS大鼠经历OIVC术后，免疫组化结果显示肾脏组织α1AR表达增强，提示α1AR有可能参与近球小管和系膜细胞的收缩，引起肾小球损害；而术前应用α1AR选择性阻滞剂后，大鼠肾脏及肾动脉组织α1AR表达均明显降低，组织形态学也显示病理改变程度较轻。表明α1AR高表达所导致的血管反应性改变是导致HRS大鼠缺血应激后损伤加重的重要因素之一。索坦罗辛为高选择性α1AAR阻滞剂，对尿道、膀胱及前列腺平滑肌上的α1AAR具有高度选择性阻断作用[9]。本实验应用高选择性α1AAR阻滞剂索坦罗辛，阻断肾动脉及肾小管α1AAR受体的表达，从而改善HRS大鼠在OIVC术中由于肾脏淤血和低灌注压导致的血管反应性紊乱，加速改善肾脏淤血及肾功能恢复的进程。
　　
　　综上所述，HRS虽属功能性肾衰竭，但由于其特有的复杂病理生理基础，在经历下腔静脉阻断所致肾静脉淤血以及低灌注压的打击后，极易出现急性肾衰竭表现，主要表现为肾血管反应性改变、肾皮质缺血以及肾小管损伤加重等。而α1AR在肾动脉及肾脏组织的高表达，提示其可能通过介导肾动脉以及肾内微血管痉挛，参与HRS以及OIVC术后缺血再灌注损伤的发病机制。本实验通过应用高选择性α1AAR阻滞剂索坦罗辛，延缓和减轻HRS大鼠在经历OIVC术后肾功衰竭的过程，提示索坦罗辛可能通过改善肾脏血管反应性，解除内源性缩血管因子所引起的微血管痉挛和微循环障碍，改善肾脏淤血水肿，发挥其肾脏保护作用。

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