作者：杨波，曹峻岭，张安，陈静宏，张增铁，付强，刘富强，陆敏灵，刘家远
【摘要】 目的 检测软骨修复组织中蛋白聚糖相关代谢指标，初步探讨在软骨修复过程中基质蛋白聚糖的代谢变化以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)和蛋白聚糖酶(aggrcanases)的作用。方法 松质骨骨基质明胶(bone matrix gelatin， BMG)复合同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨，体内植入修复兔膝关节骨软骨缺损。术后6个月取材检测蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs裂解表位BC-4 以及aggrcanases裂解表位BC-13的表达情况。结果 在修复组织中，蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)表达增加，MMPs及其裂解表位BC-4表达减低，而aggrcanases裂解表位BC-13表达阴性。结论 利用蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、BC-4、BC-13的表达情况可以初步了解修复软骨组织中蛋白聚糖的代谢变化，修复软骨组织蛋白聚糖的合成大于分解，MMPs在兔关节修复软骨基质蛋白聚糖的基础代谢和重塑中具有重要作用。
【关键词】 组织工程；修复；软骨基质；蛋白聚糖；基质代谢
ChinaABSTRACT: Objective To examine matrix proteoglycan metabolic markers and probe into the turnover of matrix proteoglycan and enzyme-mediated role of matrix metalloproteinases (MMPs) and aggrecanases in reparative tissues with tissue engineering cartilage. Methods Tissue-engineered cartilage was constructed by cancellous bone matrix gelatin (BMG) with allogeneic chondrocytes in vitro for 2 weeks， then implanted to repair osteochondral defects of rabbit knee joint. Samples were obtained 6 months later to explore the expressions of 3-B-3(-) epitope， MMPs， MMP-generated epitope BC-4 and aggrecanases-generated epitope BC-13. Results In repaired tissues， the expression of 3-B-3(-) epitope increased， but that of MMPs and MMP-generated epitope BC-4 reduced. There was no expression of aggrecanases-generated epitope BC-13. Conclusion Expressions of 3-B-3(-)， MMPs， BC-4 and BC-13 can help probe into the matrix proteoglycan turnover in reparative cartilage tissues. Anabolism exceeds catabolism in the repaired tissues. MMPs play an important role in the conservative baseline turnover of proteoglycan and remodeling of the graft tissues.
KEY WORDS: tissue engineering; repair; cartilage matrix; proteoglycan; matrix turnover
关节骨软骨损伤的治疗一直是骨科临床的难题之一。软骨下钻孔、骨膜以及软骨膜移植效果都不理想，组织工程软骨移植治疗骨软骨损伤取得了良好的效果，修复组织主要为透明样软骨[1]。但是新生组织的功能较正常关节软骨差，这主要是由于新生软骨组织没有达到正常关节软骨基质的组织结构和生物化学性能。软骨基质是软骨特有生理功能的基础，在正常成熟的关节软骨，软骨细胞外基质分子的合成与分解处于动态平衡，以保证软骨组织结构和功能的完整性，因此弄清修复软骨形成过程中基质分子代谢的机制对调控关节软骨的再生和重塑，改善修复软骨质量，促进形成透明软骨，使其更接近或达到正常关节软骨的性能具有重要的意义[2]。目前对软骨修复过程中基质分子机制的研究还很少，软骨基质分子的不同代谢状态可以被不同的抗体特异性识别，如在Ⅱ型胶原的代谢中，CⅡC1R160抗体可特异性地识别软骨细胞新合成的Ⅱ型胶原前体，而Col2-3/4m则可识别降解的胶原片断[3-4]。蛋白聚糖代谢的不同状态也有不同的抗体识别，3-B-3(-)识别软骨细胞新合成的未成熟的蛋白聚糖[5]，BC-4和BC-13分别识别基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)和蛋白聚糖酶(aggrecanases)在蛋白聚糖球间区羧基端的裂解位点[6]。利用这些特异性抗体就可以了解修复过程中软骨基质大分子代谢的变化。关节软骨基质主要由蛋白聚糖和Ⅱ型胶原组成，成人关节软骨内基质胶原10年更新一半[7]，有报道股骨头处胶原的更新大约要400年[8]，而蛋白聚糖大约每年更新一半，在软骨生长期或组织修复过程中代谢会更快，因而蛋白聚糖在修复早期能很好地反映软骨基质代谢的变化。本实验通过构建组织工程软骨移植修复兔膝关节骨软骨缺损，检测细胞外基质蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs裂解表位BC-4以及aggrcanases 裂解表位BC-13的表达情况，初步了解在组织工程修复软骨过程中细胞外基质蛋白聚糖代谢改变以及两种相关调节酶在修复软骨基质重塑中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要实验仪器和材料
新西兰兔(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，光学显微镜(Nikon，日本)，荧光显微镜(Olympus，日本)，DMEM-F12培养基、胰蛋白酶、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)标记山羊抗小鼠IgG(Gibco，美国)，胎牛血清(北京，元亨圣马)，正常山羊封闭血清液、DAB显色液、山羊抗小鼠IgG-HRP(北京中山金桥)，碘化丙啶(Sigma，美国)，MMP(Chemicon， 美国)，硫酸软骨素酶ABC、单克隆抗体3-B-3、BC-4、BC-13 (英国加的夫大学Bruce Caterson教授提供)。
1.2 松质骨骨基质明胶的制备
取4～5月龄新西兰兔长骨干骺端以及髂骨处松质骨，按文献[9]方法制备松质骨骨基质明胶(bone matrix gelatin， BMG)。将制备的松质骨修成直径约3mm、厚3mm的圆柱状，环氧乙烷灭菌后存于-30℃备用。
1.3 组织工程软骨移植修复膝关节骨软骨缺损
取28d新西兰幼兔1只，无菌条件下分离肱骨、股骨和胫骨关节面软骨，体外单层原代培养[10]后收集细胞，制成107/mL的细胞悬液，按106/管接种到已经放有松质骨BMG的10mL离心管内，静置2h后加入4mL含150mL/L胎牛血清的DMEM-F12培养液，培养2周后移植修复兔股骨内侧髁骨软骨缺损(直径3mm，深3mm；n=6)，术后兔子笼内自由活动。
1.4 组织学染色
手术后6个月取股骨髁修复组织标本，甲醛溶液固定24h，EDTA脱钙1月左右，系列乙醇脱水，石蜡包埋，5μm切片，进行苏木苏-伊红(HE)、甲苯胺兰(TB)、天狼猩红、蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs降解表位BC-4、aggrecanases降解表位BC-13的染色。
1.4.1 3-B-3(-)、BC-13、BC-4免疫荧光染色
石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。于2mL/L Triton X-100室温下25min；加入0.1u硫酸软骨素酶ABC 37℃孵育45min(3-B-3无此步骤)；加50mL/L山羊正常血清封闭液以消除非特异性染色，室温45min，吸去多余液体，不洗；滴加一定比例稀释的一抗(3-B-3、BC-13、BC-4)，4℃过夜(18h以上)；37℃复温45min后加入1∶100稀释的FITC标记的二抗，37℃孵育45min；加碘化丙啶复染细胞核，5min。上述各步间均用PBS缓冲液浸洗3次，每次5min。碳酸盐-甘油封片剂封片，荧光显微镜下观察。
1.4.2 MMPs免疫组织化学染色
石蜡切片，常规脱蜡和水化后，2mL/L Triton X-100室温25min；3mL/L h3O2(甲醛配制)室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；1g/L胰蛋白酶37℃湿盒孵育30min；50mL/L山羊正常血清封闭液37℃ 45min，吸去多余液体，不洗；滴加1∶1000稀释的MMP单克隆抗体，4℃过夜(大于18h)；37℃复温45min后加入1∶100稀释的HRP标记的二抗，37℃孵育45min。上述各步间均用PBS缓冲液浸洗3次，每次5min。滴加新鲜配制的DAB，室温显色10min，蒸馏水洗。苏木素复染，水性封片剂封片，光学显微镜下观察。
2 结 果
2.1 形态学观察
松质骨BMG复合软骨细胞移植体内修复同种异体兔膝关节骨软骨缺损，术后6个月肉眼观察显示修复组织与周围正常软骨已愈合，修复组织表面基本平整，颜色与周围正常软骨组织近似(图1A)。HE染色显示修复交界区整合良好，不易辨认。修复组织为透明样软骨组织，深层细胞柱状排列，软骨细胞存在软骨陷窝内，重建了软骨下骨板(图1B)。基质染色显示修复组织基质蛋白聚糖(图1C)和胶原(图1D)表达接近周围正常软骨，分布均匀。
2.2 蛋白聚糖代谢改变
修复组织中下层3-B-3(-)表达阳性，细胞浆染成绿色，显示修复组织合成新的蛋白聚糖(图2A)。BC-13在修复组织和周围正常软骨染色都为阴性(图2C)。MMPs主要存在于修复组织的中下层，部分细胞质染成棕黄色(图2D)。MMPs裂解表位BC-4染色阳性，细胞质染成绿色，中下层染色重(图2F)。
3 讨 论
关节软骨没有血液供应和神经支配，损伤后自身修复能力有限，许多学者尝试用组织工程化软骨来修复关节缺损，获得了较为满意的效果，修复组织主要为透明样软骨。但是新生软骨的功能差于正常关节软骨，这可能是由于新生软骨组织尚未达到正常关节软骨基质的组织结构和生物化学性能，而软骨基质是软骨特有生理功能的基础，所以临床上要想重建关节软骨，恢复关节的功能，修复软骨组织基质分子代谢的机制研究就显得很重要。本实验应用4种单克隆抗体3-B-3(-)、MMPs、BC-4、BC-13，初步探讨组织工程修复软骨基质中蛋白聚糖的代谢及两种相关调节酶MMPs和aggrecanases的作用。
蛋白聚糖是软骨基质的主要成分之一，填塞于Ⅱ型胶原所构成的网状结构中，单体由一条核心蛋白与一至上百条氨基聚糖链组成。蛋白聚糖含有许多酸性基团，能吸纳大量的水分，从而保证关节软骨良好的黏弹性，完成抵抗压力的功能。
3-B-3(-)是指在利用3-B-3作为一抗孵育前，不用硫酸软骨素ABC酶对样本进行预处理。3-B-3(-)识别的位点是一个由饱和的己糖醛酸和一个N-乙酰半乳糖胺构成的二糖单位，该位点位于完整的CS链末端，在有3-B-3(-)表达的地方，说明此处存在有新合成的蛋白聚糖。利用3-B-3(-)进行的一系列研究发现：其主要表达于未成熟和处于生长、重构期的关节软骨组织，正常成年关节软骨肥大细胞区[5]。3-B-3(-)的表达常被视为蛋白聚糖合成的标志，在修复软骨组织中，新合成蛋白聚糖意味着软骨细胞试图修复、重塑软骨组织。本研究中修复组织3-B-3(-)表达位于修复组织中下层，显示修复组织合成新的蛋白聚糖。
MMPs和aggrecanases是调控软骨细胞外基质蛋白聚糖代谢最主要的两种酶。MMPs降解蛋白聚糖时最重要的裂解位点位于核心蛋白(interglobulin domain， IGD)Asn341～Phe342之间，酶切这一肽键可以产生C-末端序列为VDIPEN的新表位，是 BC-4特异性的识别位点；aggrecanases降解蛋白聚糖时最重要的裂解位点位于IGD区Glu373～Ala374之间，酶切这一肽键可以产生C-末端序列为NITEGE的新表位，可以被BC-13特异性识别[12]。研究显示在人的软骨组织代谢中，MMPs和aggrecanases两种酶在正常关节软骨基质蛋白聚糖的基础代谢、软骨损伤蛋白聚糖的降解以及修复软骨组织重塑中都具有重要作用[13-14]。但在动物体内外实验研究显示，MMPs和aggrecanases在基质蛋白聚糖代谢中的作用不同。
体外培养兔[15]、猪[16]的软骨组织发现，aggrecanases降解片段表达阴性，而MMPs降解片段表达阳性，当用炎性因子IL-1刺激后，aggrecanases活性明显增强，降解片断增加，而MMPs活性表达不变，或改变不明显。鼠关节炎关节软骨中aggrecanases的降解片段表达明显增加，而敲除aggrecanases基因，可以明显减轻或阻止鼠关节炎的发生[17-19]。以上结果显示MMPs 在基质蛋白聚糖的基础代谢中起重要作用，而aggrecanases的主要作用是在软骨受到损伤时降解蛋白聚糖。本实验中，MMPs及其降解片段BC-4在体内修复组织和正常软骨组织表达阳性，而aggrecanases的降解片段BC-13表达阴性，显示MMPs在兔软骨基质蛋白聚糖基础代谢以及修复重塑中起重要作用，与文献报道一致，而aggrecanases主要作用是在软骨受到损伤时降解蛋白聚糖[15，20]。
关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，软骨细胞合成并分泌蛋白聚糖和胶原在内的多种基质成分，同时也合成多种降解基质的酶。生理情况下，成熟软骨组织细胞外基质的合成和分解之间相互制约，相互作用，维持着代谢的动态平衡，从而保证软骨组织结构和功能的完整性[2，21]。在骨关节炎(osteoarthritis， OA)及急性关节损伤等病理状态下，这种动态平衡被打破，各种损伤因素可以引起肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)、白细胞介素1(interleukin-1， IL-1)升高，组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase， TIMP)和ɑ-2巨球蛋白(ɑ-2 macroglobulin， ɑ2M)表达下降，MMPs和aggrecanases表达增加，活性增强，细胞外基质蛋白聚糖和胶原分解大于合成，关节软骨受损，功能减弱[22-23]。
在关节软骨损伤过程中蛋白聚糖与胶原的代谢变化以及和相关调节分子之间的关系已有了一定的了解，而在修复过程中这些分子的表达状况及其关系研究的很少。FRISBIE[24]和BARNEWITZ[25]用构建的组织工程软骨移植修复关节骨软骨缺损，在缺损处形成透明样软骨，但是修复组织质量差于正常关节软骨。软骨组织代谢比较慢，修复的软骨组织是否会随着时间的推移发生重塑，接近或达到正常关节软骨的生物性能？要回答上面的问题，软骨修复过程中基质分子代谢机制的研究就很重要。JAMES等[26]体外构建的组织工程软骨，在生理机械力作用下IL-1、MMP-1、aggrecanases等表达下降，转化生长因子-β表达上升，胶原和糖氨聚糖合成增加。根据相关研究[26-27]推测，在软骨修复过程中，参与细胞外基质合成代谢的大分子(TIMP、ɑ2M等)表达增多、活性增强，而参与分解代谢的大分子(MMPs、aggrecanases等)则相对表达降低、活性减弱，胶原和蛋白聚糖合成大于分解，才能修复软骨缺损。在本研究中，软骨修复组织蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)表达增加，而MMPs及其降解表位BC-4表达降低，修复组织合成代谢大于分解代谢，修复损伤的软骨组织，这与生长期软骨组织的合成代谢大于分解代谢相似[2]。软骨组织代谢比较慢，随着时间的推移修复软骨组织的合成与分解代谢是否会达到平衡，是否会成功重塑、再生损伤的软骨，使其接近或达到正常关节软骨还需要做进一步的长期研究。
参考文献
[1]CHUNG C， BURDICK JA. Engineering cartilage tissue [J]. Adv Drug Deliv Rev， 2008， 60:243-262.
[2]AIGNER T， SOEDER S， HAAG J. IL-1 and BMPs interactive players of cartilage matrix degradation and regeneration [J]. Eur Cell Mater， 2006， 12:49-57.
[3]AURICH M， MWALE F， REINER A， et al. Collagen and proteoglycan turnover in focally damaged human ankle cartilage [J]. Arthritis Rheum， 2006， 54(1):244-252.
[4]FRASER A， FEARON U， BILLINGHURST RC， et al. Turnover of type II collagen and aggrecan in cartilage matrix at the onset of inflammatory arthritis in humans [J]. Arthritis Rheum， 2003， 48(11):3085-3095.
[5]LIN PM， CHEN CT， TORZILLI PA. Increased stromelysin-1 (MMP-3)， proteoglycan degradation (3B3- and 7D4) and collagen damage in cyclically load-injured articular cartilage [J]. Osteoarthritis Cart， 2004， 12(6):485-496.
[6]JANUSZ MJ， LITTLE CB， KING LE， et al. Detection of aggrecanase- and MMP-generated catabolic neoepitopes in the rat iodoacetate model of cartilage degeneration [J]. Osteoarthritis Cartilage， 2004， 12(9):720-728.
[7]THOMPSON RC Jr， ROBINSON HJ Jr. Articular cartilage matrix metabolism [J]. J Bone Joint Surg Am， 1981， 63A(2):327-331.
[8]EYRE D. Collagen of articular cartilage [J]. Arthritis Res， 2002， 4(1):30-35.
[9]LI XD， JIN Li， BALIAN G， et al. Demineralized bone matrix gelatin as scaffold for osteochondral tissue engineering [J]. Biomaterials， 2006， 27:2426-2433.
[10]魏西秦，曹峻岭，熊咏民. 兔软骨细胞培养方法研究 [J]. 中国地方病学杂志，1987， 6(2):89-92.
[11]HUANG K， WU LD. Aggrecanase and aggrecan degradation in osteoarthritis:a review [J]. J Int Med Res， 2008， 36(6):1149-1160.
[12]HAYES AJ， HUGHES CE， CATERSON B. Antibodies and immunohistochemistry in extracellular matrix research [J]. Methods， 2008， 45:10-21.
[13]STRUGLICS A， LARSSON S， PRATTA MA， et al. Human osteoarthritis synovial fluid and joint cartilage contain both aggrecanase- and matrix metalloproteinase-generated aggrecan fragments [J]. Osteoarthritis Cartilage， 2006， 14(2):101-113.
[14]ROBERTS S， HOLLANDER AP， CATERSON B， et al. Matrix turnover in human cartilage repair tissue in autologous chondrocyte implantation [J]. Arthritis Rheum， 2001， 44(11):2586-2598.
[15]SABATINI M， THOMAS M， DESCHAMPS C， et al. Effects of ceramide on aggrecanase activity in rabbit articular cartilage [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2001， 283(5):1105-1110.
[16]HUGHES CE， LITTLE CB， BUTTNER FH， et al. Differential expression of aggrecanase and matrix metalloproteinase activity in chondrocytes isolated from bovine and porcine articular cartilage [J]. J Biol Chem， 1998， 273(46):30576-30582.
[17]GLASSON SS， ASKEW R， SHEPPARD B， et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis [J]. Nature， 2005， 434:644-648.
[18]MAJUMDAR MK， ASKEW R， SCHELLING S， et al. Double-knockout of ADAMTS-4 and ADAMTS- 5 in mice results in physiologically normal animals and prevents the progression of osteoarthritis [J]. Arthritis Rheum， 2007， 56(11):3670-3674.
[19]LITTLE CB， MEEKER CT， GOLUB SB， et al. Blocking aggrecanase cleavage in the aggrecan interglobular domain abrogates cartilage erosion and promotes cartilage repair [J]. Clin Invest， 2007， 117(6):1627-1636.
[20]SANDY JD. A contentious issue finds some clarity: on the independent and complementary roles of aggrecanase activity and MMP activity in human joint aggrecanolysis [J]. Osteoarthritis Cartilage， 2006， 14(2):95-100.
[21]HENDREN L， BEESON P. A review of the differences between normal and osteoarthritis articular cartilage in human knee and ankle joints [J]. Foot， 2009， 19:171-176.
[22]ROWAN AD. Cartilage catabolism in arthritis:factors that influence hemeostasis [J]. Expert Rev Mol Med， 2001， 3(17):1-20.
[23]ABRAMSON SB. Osteoarthritis and nitric oxide [J]. Osteoarthritis Cartilage， 2008， 16 (2):15-20.
[24]FRISBIE DD， BOWMAN SM， COLHOUN HA， et al. Evaluation of autologous chondrocyte transplantation via a collagen membrane in equine articular defects: results at 12 and 18 months [J]. Osteoarthritis Cartilage， 2008， 16(6):667-679.
[25]BARNEWITZ D， ENDRES M， KR GER I， et al. Treatment of articular cartilage defects in horses with polyer-based cartilage tissue engineering grafts [J]. Biomaterials， 2006， 27:2882-2889.