NFκB及其相关炎性因子致大鼠移植肝冷保存损伤的机制

　　　　 作者：蒋安，刘峰，刘昌，宋宇龙，孟珂伟，吕毅蒋安

【摘要】 目的 通过大鼠移植肝在不同冷保存时间再灌注后核因子κB(nuclear transcription factorκB， NFκB)及其相关炎性因子的激活情况，判断冷保存时间、NFκB激活以及移植肝功能损伤三者之间的联系。方法 用Wistar大鼠建立原位肝移植模型，假手术组(A组)作为对照组，观察大鼠移植肝在4℃ UW液中保存45min(B组)、120min(C组)、180min(D组)以及再灌注3h后肝组织、血清中NFκB、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1β)和肝损伤指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肝细胞凋亡的变化情况。结果 随着移植肝冷保存时间的延长NFκB逐渐激活(P<0.05)，并使肝组织内TNFα、IL1β水平上调(P<0.05)；再灌注后，NFκB近一步激活(P<0.05)，肝组织中TNFα、IL1β进一步上调(P<0.05)，ALT、AST和肝细胞凋亡指数明显升高(P<0.05)，肝功能损害加重。结论 NFκB在供肝的冷保存阶段随时间的延长呈诱导性激活，再灌注后呈爆发式激活，并通过上调其靶基因TNFα、IL1β的转录产生肝脏损伤，这可能是肝脏冷保存再灌注损伤发生的重要机制。

【关键词】 肝移植；器官保存；冷保存再灌注损伤；核因子κB

　　ABSTRACT: Objective To establish a model of rat orthotopic liver transplantation and investigate the relationship among cold preservation time， activation of nuclear transcription factorκB (NFκB) and donor preservation injury after liver transplantation. Methods Orthotopic liver transplantation was performed in Wistar rats which were randomly pided into the following groups according to the different duration of liver cold storage in UW solution: group A (sham operation， n=10)， group B (45min cold storage group， n=10)， group C (120min cold storage group， n=10)， and group D (180min cold storage group， n=10). The expression of NFκB in liver before and after transplantation was measured by electrophoretic mobility shift assays; protein expression of tumor necrosis factoralpha (TNFα) and interleukin1 beta (IL1β) in the liver was measured by immunohistochemistry; the serum TNFα and IL1β， alanine aminotransferase (ALT)， aspartate aminotransferase (AST) and hepatic cell apoptosis were examined. Results With extended cold storage duration， the activity of NFκB in the donor liver increased (P<0.05， group D vs. groups A， B and C). TNFα and IL1β levels also increased (P<0.05， group D vs. groups A， B and C). Donor liver reperfusion injury was gradually aggravated with the prolonging of graft cold preservation. Both the serum TNFα and IL1β levels increased highly (P<0.05 group A vs. groups B， C and D)，and the expression of NFκB in the liver significantly increased (P<0.05， group A vs. groups D， B and C) with gradual prolonging of graft cold preservation time. The serum ALT and AST level and apoptosis index level elevated greatly (P<0.05， group A vs. groups D， B and C). Conclusion NFκB of donor liver was activated inductively in cold preservation phase and activated explosively in reperfusion phase. The longer cold preservation time was， the higher NFκB level in donor liver became. NFκB led to the expression of TNFα and IL1β in donor liver. Inflammatory factors are one of the most important mechanisms for the donor liver injury after liver transplantation.

　　KEY WORDS: liver transplantation; organ preservation; cold preservationwarm reperfusion injury; nuclear transcription factorκB

　　移植肝冷保存再灌注损伤(cold preservationwarm reperfusion injury， P/RI)是移植肝功能不良(poor graft function， PGF)和原发性无功能(primary nonfunction， PNF)的直接原因[1]。PGF及其严重形式PNF的发生率分别占移植总数的5%～10%[2]和1.4%～8.5%[3]。PNF占术后1周内再次肝移植病因的81%和再次肝移植总病因的21.7%[1]，危害严重。冷保存时间超过20h，PNF发生率是保存4h以内的4倍[4]，所以冷保存时间是PNF的独立预测因子[5]。而且，P/RI还可导致多器官功能不全和胆管非吻合口狭窄等并发症[6]，严重影响患者预后。因此，如何最大限度地减轻供肝冷保存损伤、提高移植物成活率是当今肝移植领域面临的重要课题。本实验通过研究移植肝P/RI过程中核转录因子κB(nuclear transcription factorκB， NFκB)及其相关炎性因子的表达变化，探讨NFκB在移植肝冷保存中的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型的制作

　　清洁级健康成年封闭群雄性Wistar大鼠70只(第四军医大学实验动物中心提供)，体重(272±31)g。术前禁食12h，不禁饮，清洁手术。氯胺酮100mg/kg体重腹腔注射麻醉。采用改良两袖套法建立大鼠全血供原位肝移植模型[7]。

　　1.2 实验动物分组

　　依据供肝冷保存时间的不同，将Wistar大鼠随机分为4组，每组10只：A组，假手术组；B组，冷保存45min再灌注3h组；C组，冷保存120min再灌注3h组；D组，冷保存180min再灌注3h组。供肝以4℃ UW液保存，冷保存结束前，留取乳头叶腹侧叶片。移植肝植入3h后，留取乳头叶背侧叶片，并取血留作标本。

　　1.3 观察指标及检测方法

　　1.3.1 肝组织NFκB水平的测定

　　凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assays， EMSA)按YANG等[8]的方法提取肝组织的核蛋白，-70℃冻存备用，用考马斯亮蓝蛋白浓度检测试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)测定蛋白浓度。结合NFκB的寡核苷酸探针(上海生工生物工程技术有限公司合成)双链核苷酸序列为5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3′，3′TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G5′，以γ32PATP(北京福瑞生物工程公司产品)进行探针标记。室温下将2μL 5×凝胶滞留结合缓冲液、核蛋白10μg、鲑精DNA(4g/L)1μL混匀，10min后加入γ32PATP标记的NFκB探针2μL，反应30min后加入5×上样缓冲液2μL，60g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳2h(110V)后，-70℃放射自显影6h。X光片置于BIORAD凝胶图象分析系统测定NFκB活性值(A值)来表示提取物中NFκB的DNA结合活性。NFκB活性值(A)=滞后带吸光度值(A)×滞后带面积值(S)。

　　1.3.2 冷保存期肝组织TNFα和IL1β的测定

　　采用免疫组化SABC法在石蜡切片上测定TNFα和IL1β的表达。TNFα和IL1β主要定位于细胞质内，表现为胞质黄染或棕黄色颗粒。免疫组化染色结果判定参照MATTERN的方法[9]。阳性染色深度：未见染色为0，轻度染色(染成浅黄色)为1，中度染色(染成棕黄色)为2，深度染色(染成棕褐色)为3；阳性细胞百分比：未见染色为0，染色细胞<25%为1，25%～50%为2，>50%为3。将这两方面得分相加，得分0～2分判为阴性表达，>2分(3～6)判为阳性表达。每组10例标本，每例标本随机选择10个高倍视野，记数100个细胞判定此例标本的表达为阳性或阴性，并计算阳性表达率。

　　1.3.3 TUNEL法检测肝细胞凋亡

　　肝组织石蜡切片厚4μm，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测。按DeadEndTM TUNEL检测试剂盒(Promage， USA)操作说明进行操作。阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色着色。每张切片光镜(20×15)观察10×500个细胞，计算每100个细胞中平均阳性细胞数，即凋亡指数(apoptosis index， AI)。

　　1.3.4 再灌注后血清TNFα、IL1β的测定

　　血清TNFα、IL1β采用双抗体夹心ELISA法，试剂盒购自晶美生物工程公司，采用德国FLUO star OPTIMA高通量微板测试系统测定。

　　1.3.5 再灌注后血清ALT、AST的检测

　　采用日立生化分析仪7160，进行血清ALT、AST的检测。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS13.0软件，实验数据以均数±标准差(±s)表示。各组样本间均数用单因素方差分析比较，各组间阳性率用四格表的确切概率法比较。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠肝移植模型的制备情况

　　正式实验共进行大鼠肝移植手术30例，手术死亡3例，成功率90%。供体手术(18.6±5.2)min，供肝修整(8.5±3)min；受体手术(30.2±6.4)min，无肝期(15.5±3.3)min。门静脉开放后，肝脏颜色迅速变红，并可以看到少量金黄色胆汁分泌。3h时存活受体大鼠可自行活动、饮水，满足获取标本需要。

　　2.2 肝组织冷缺血期和再灌注期NFκB的测定结果

　　NFκB在B组和C组冷保存期均呈现不同程度活化，组间比较无统计学差异(P>0.05)。D组同其他冷保存组相比，NFκB活性显著增高(P<0.05)。再灌注后，B组、C组和D组NFκB活性均较假手术组活性水平增高(P<0.05)。随着冷保存时间的延长，NFκB活性增高(P<0.05，表1、图1)。表1 不同冷保存时间组移植肝NFκB的活性（略）

　　2.3 冷保存期肝组织TNFα、IL1β的测定结果

　　随着冷保存时间的延长，TNFα和IL1β在肝组织中的阳性表达率逐渐升高，D组TNFα和IL1β的阳性表达率较A、B、C组明显升高(P<0.05，表2)。表2 不同冷保存时间肝组织TNFα及IL1β的表达（略）

　　2.4 再灌注期血清TNFα、IL1β及ALT、AST的测定结果

　　再灌注后，B、C、D组TNFα和IL1β均较假手术组明显升高(P<0.05)，而且随着冷保存时间延长，两种细胞因子活性均升高(P<0.05)。随着冷保存时间的延长，再灌注后血清转氨酶水平升高，组间比较差异有统计学意义(P<0.05，表3)。表3 再灌注后血清TNFα、IL1β、ALT、AST水平和细胞凋亡指数(AI)的变化（略）

　　2.5 再灌注后肝细胞的凋亡情况

　　凋亡细胞在TUNEL染色中显示为棕色或褐色小点。A组为正常肝组织，凋亡细胞罕见；随着冷保存时间的延长，移植肝再灌注后凋亡细胞在B、C、D组中表达逐渐增多，在中央静脉周围分布较多。经统计后得出：随着冷保存时间的延长AI值逐渐升高，B、C 、D组AI值均较A组明显升高(P<0.05)，而且组间比较差异有统计学意义(P<0.05，表3、图2)。

　　3 讨 论
　　
　　NFκB是一类能与多种基因的启动子或增强子κB位点发生特异性结合并启动基因转录的蛋白质。胞质中的NFκB/IκB三聚体，可被TNFα、IL1β、活性氧等多种细胞外刺激信号激活，继而NFκB活化入核，与靶基因特异性序列结合并启动转录。转录产物包括黏附分子、趋化因子和细胞因子(TNFα、IL1β)等，这些炎性介质参与P/RI的病理过程[10]。
　　
　　在本实验中可见，随着供肝冷保存时间的延长，供肝中NFκB水平显著增高。其机制可能是随冷保存时间延长，内皮细胞和Kupffer细胞内氧自由基增多，低氧及氧化应激介导NFκB激活，调控TNFα、IL1β表达增高[11]。再灌注后各组肝组织中NFκB以及血清TNFα、IL1β水平均较冷保存期明显增高，并随着冷保存时间的延长活性增强。TUNEL显示肝细胞凋亡加重，反映肝损伤的酶学指标(ALT、AST)亦明显升高，表明再灌注后NFκB产生爆发式激活，转录大量TNFα、IL1β，进一步加重供肝的损伤。其机制可能与移植肝再灌注后呼吸爆发、氧化应激大大增强有关，而其转录产物如TNFα、IL1β又可进一步激活NFκB，形成正反馈。
　　
　　可见，供肝的冷保存和再灌注是两个既独立又关联的过程。供肝的NFκB在冷保存期间就已经受到预激，并表达多种炎症介质，成为再灌注损伤的始动因子；在再灌注阶段NFκB的效应迅速放大，进一步激发并维持炎症反应，损伤供肝[12]。其中TNFα在肝损伤中发挥重要作用，可以直接或诱导肝细胞坏死、凋亡[13]；而IL1β诱导Kuppfer细胞产生TNFα，上调中性粒细胞产生更多的自由基。二者的协同作用引起血管扩张和白细胞介导的组织坏死，最终导致器官衰竭。NFκB与细胞凋亡的关系密切， 其参与多种凋亡相关基因的转录调控， 具有抑制细胞凋亡作用及促细胞凋亡的双向作用，可能与不同亚基的转录有关，可以不通过炎性因子的作用，直接导致细胞凋亡[14]。在本实验中NFκB显示出促进肝细胞凋亡的作用。
　　
　　总之，随着移植肝冷保存时间的延长，肝内NFκB存在不同程度的预激，再灌注后大量活化的NFκB通过上调TNFα、IL1β的表达直接或间接导致移植肝的损伤。这可能是移植肝再灌注损伤的重要机制，而抑制NFκB可能是一条减轻移植肝再灌注损伤的有效方法。

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