慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的防治作用

　　　　 作者：马燕花，杨少军，赵建雄

【摘要】 目的 观察中药慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的防治作用。方法 建立非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型，随机分为正常组、模型组、慈菇消脂丸高剂量组、慈菇消脂丸低剂量组、东宝肝泰阳性药物对照组，观察肝组织病理形态学的变化，检测肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)的含量。免疫组化技术检测环氧合酶2(COX2)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在肝脏的表达。结果 模型组大鼠肝组织出现脂肪变性及不同程度的炎性细胞浸润，镜下可见肝细胞内大量脂滴。与正常组相比较，模型组大鼠肝组织内SOD活性显著降低，MDA、NO含量显著提高，COX2、iNOS蛋白表达显著提高，差异具有统计学意义；与模型组相比较，中药治疗组大鼠肝组织内SOD活性显著提高，MDA、 NO含量显著降低，COX2、 iNOS蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义；中药慈菇消脂丸高剂量组作用亦较阳性药物对照组显著。结论 慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎具有明显的防治作用，其作用机制与改善肝组织脂肪变性程度、抑制脂质过氧化、抗炎有关。

【关键词】 非酒精性脂肪性肝炎；慈菇消脂丸；环氧合酶2；诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮

　　ABSTRACT: Objective To observe the preventive and therapeutic effects of Sagittara Sagittifolia L. XiaoZhi Pills on nonalcoholic steatohepatitis (NASH) in rats. Methods Rat NASH models were established and the rats were pided randomly into five groups: the normal group， model group， highdosage group and lowdosage groups of the treatment， and Dongbao Gantai positive drug group. Histopathological changes of the liver were observed. The levels of MDA， superoxide dismutase (SOD)， and NO (nitric oxide) in the liver homogenate were determined. Expressions of cyclooxygenase2 (cox2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the liver were determined with immunohistochemical technique. Results In model group， extensive adipose degeneration and inflammatory cell infiltration were found in the liver. Compared with those in normal group， SOD activities in model group were obviously decreased (P<0.01)， the contents of MDA and NO were obviously increased (P<0.01)， and the expressions of cox2 and iNOS proteins were obviously increased (P<0.01). Compared with those in model group， the activities of SOD in treatment groups were obviously increased (P<0.01)， the contents of MDA and NO were obviously decreased (P<0.01)， and the expressions of COX2 and iNOS proteins were obviously decreased (P<0.01). The effect of highdosage group was more obvious than that of Dongbao Gantai group (P<0.05). Conclusion Sagittara Sagittifolia L. XiaoZhi Pills can effectively prevent and treat nonalcoholic steatohepatitis in rats， and its mechanism may be associated with ameliorating hepatocellular steatosis， removing the free radicals and enhancing the antioxidation and antiinflammation capability.

　　KEY WORDS: nonalcoholic steatohepatitis; Sagittara Sagittifolia L. XiaoZhi Pills; cyclooxygenase2; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide

　　1980年，LUDWID等[1]首先提出了非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis， NASH)的概念，是以无过量饮酒史以及肝细胞脂肪变性、气球样变、弥漫性肝小叶炎症和(或)肝中央静脉、肝窦周围胶原沉积为特征的慢性肝脏疾病。发病机制至今尚未明确，DAY和JAMES等[2]根据动物实验的结果提出两次打击学说。目前缺乏有效的防治手段。脂肪肝属祖国医学“肥气”、“癥瘕”、“积聚”范畴，肝郁、痰湿、瘀血、浊毒为其主要发病机制。本文拟通过动物实验探讨中药慈菇消脂丸对非酒精性脂肪性肝炎的防治作用及其可能的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　雄性SD大鼠，SPF级，体重200～240g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK2004006。

　　1.1.2 实验药物

　　慈菇消脂丸由山慈菇、泽泻、柴胡、生山楂、决明子、甘草等10味药物组成，甘肃中医学院附属医院制剂中心提供，生产批号：071217。东宝肝泰片，由通化东宝药业股份有限公司提供，批号：070508。普通饲料和高脂饲料由北京可澳协力饲料有限公司提供。

　　1.1.3 主要的试剂和仪器

　　超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、微量丙二醛(MDA)测定试剂盒、NO试剂盒由南京建成生物工程公司提供。Sp9001兔SP免疫组化试剂盒由北京金桥中杉公司提供。Rabbit antiCOX2一抗、Rabbit antiiNOS 一抗、DAB(显色剂)购自武汉博士德生物工程有限公司。DZW4型恒温水浴箱，金坛市恒丰仪器厂。BP211D型电子天平，Sartorius公司。PLCO型台式高速离心机，德国Heraeus公司。UNICOUV2102C型紫外分光光度仪，日本岛津公司。

　　1.1.4 高脂饲料配方

　　普通饲料82.5%，10%猪油，2%胆固醇，0.5%胆酸钠，5%蛋黄粉。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠脂肪肝模型的建立[3]与给药方法

　　50只SD雄性大鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、慈菇消脂丸高剂量组、慈菇消脂丸低剂量组、阳性药物对照组。正常组普通饲料喂养，其余4组均采用高脂饲料喂养，同时按大鼠体重2mL/kg 400g/L四氯化碳豆油溶液，皮下注射，每周2次。造模4周后，四氯化碳模型组分为高剂量给药组，给药剂量为1.6g/kg，给药体积10mL/kg大鼠；低剂量给药组，给药剂量为0.80g/kg；阳性给药组，给药剂量为0.32g/kg；模型对照组给予同体积生理盐水。连续给药30d后解剖所有大鼠，取出肝脏，称重，迅速从肝左叶中部切取一小块肝组织，按常规制备石蜡切片保存备用。

　　1.2.2 检测体重、肝脏指数

　　麻醉动物后称量体重、肝重，并计算肝脏指数(肝湿重/体重×100%)

　　1.2.3 生化指标测定

　　取肝右叶约0.5g，4℃下制成100g/L(10%)肝匀浆， 分别测定 SOD、MDA、NO。按照试剂盒说明书操作。

　　1.2.4 肝脏组织HE染色

　　取肝左叶组织，100mL/L中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm切片，HE染色后在显微镜下观察肝组织的病理学变化。

　　1.2.5 免疫组化染色检测COX2、iNOS表达

　　采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶免疫组化法(SP)。肝组织石蜡切片常规脱蜡至水，用高温进行抗原修复，30mL/L过氧化氢灭活内源性酶后，50g/L BSA封闭20min，滴加不同浓度特异性一抗后4℃过夜，次日滴加偶联二抗，室温30min后DAB显色，苏木精复染，透明，封片。每次实验均设阴性对照，以PBS缓冲液代替一抗，结果显示阴性。

　　1.3 统计学处理

　　采用统计软件SPSS11.0进行统计学分析，数据以均数±标准差(±s)表示，显著性检验采用单因素方差分析，检验水准为0.05，差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠肝脏指数、肝组织SOD活力、MDA、NO含量的比较
　　模型组肝脏指数较正常对照组显著增加(P<0.01)；与模型组相比较，中药高剂量组及阳性药物对照组肝脏指数均明显下降(P<0.05)；而中药低剂量组肝脏指数则无明显改变(P>0.05)；中药治疗组与阳性药物组之间亦无明显差异(P>0.05)。与正常组相比较，模型组大鼠肝组织内SOD活性显著降低(P<0.01)，MDA、 NO含量显著提高(P<0.01)，差异具有统计学意义；与模型组相比较，中药治疗组大鼠肝组织内SOD活性显著提高(高剂量组P<0.01，低剂量组P<0.05)，MDA、 NO含量显著降低(高剂量组P<0.01，低剂量组P<0.05)，差异具有统计学意义；除NO外，其他指标中药慈菇消脂丸高剂量组作用均较阳性药物对照组显著(P<0.05，表1)。表1 慈菇消脂丸对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏指数、肝组织SOD、MDA、NO含量的影响（略）

　　2.2 肝组织病理学的变化

　　给药30d后解剖，肉眼观察正常对照组大鼠肝脏为红色，边缘锐利，表面光滑，模型组肝脏明显肿大，呈黄色缺血状。给药各组肝肿大有所缓解，颜色变红。HE染色镜下观察，正常对照组肝小叶结构完整，肝细胞呈多边形围绕中央静脉呈放射状，肝窦清晰可见，肝索排列整齐。CCl4模型组肝小叶结构破坏，肝细胞弥漫性脂肪变性，脂滴大小不等，部分融合为大脂滴，界限不清。肝索紊乱，少数可见点状坏死，碎霄样坏死和炎性细胞浸润。中药高剂量组肝小叶结构完整，脂肪变性细胞数目明显减少，反见一些细小脂滴散布于细胞内，肝索排列整齐。中药低剂量组肝小叶结构尚清晰，脂肪变性细胞数目明显减少，胞浆内脂滴减少或消失，反见一些细小脂滴散布于细胞内，偶见个别大脂滴，肝索排列整齐。阳性药物对照组表现同中药高剂量组(图1)。

　　2.3 肝组织COX2、iNOS的表达

　　阳性细胞为胞浆或核膜呈棕黄色或棕褐色颗粒。COX2、iNOS主要表达于血管内皮细胞及肝小叶中央静脉周围的肝细胞、枯否细胞内。在200倍镜下，用高清晰度彩色图像病理图文分析系统测量其吸光度值。每张切片随机选取5个视野，计算平均吸光度值，以平均吸光度值作为蛋白表达的半定量参数。正常对照组几乎无COX2、 iNOS蛋白表达；与正常对照组相比较，模型组大鼠肝组织COX2、 iNOS蛋白表达显著提高(P<0.01)，差异具有统计学意义；与模型组相比较，中药治疗组大鼠肝组织COX2、 iNOS蛋白表达显著降低(中药高剂量组P<0.01，中药低剂量组P<0.05)，差异具有统计学意义；中药慈菇消脂丸高剂量组作用亦较阳性药物对照组显著(表2、图2和图3)。表2 慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪肝COX2、 iNOS表达的影响（略）

　　3 讨论
　　
　　现代医学以“两次打击”学说为非酒精性脂肪性肝炎发病的核心机制，即第一次打击为各种原因引起脂质代谢紊乱，导致肝脏脂肪沉积及肝脂肪变，并启动细胞适应程序，而脂肪变性的肝细胞活力相对不足并为氧应激提供了足够的反应基质，结果脂肪变性的肝细胞对内、外源性损害因子的敏感性增强；第二次打击主要为氧应激脂质过氧化损伤引起炎症坏死。活性氧(ROS)可改变线粒体膜通透性转变孔的开关，通过与TNFα和FAS配体相互作用导致肝细胞死亡；激活核转录因子(NFκB和AP1)，调节参与炎症应答的一些细胞因子和黏附因子(TNFα、IL18、TGFβ)的表达；刺激花生四烯酸的代谢，产生白三烯等类脂质以趋化中性粒细胞；通过攻击生物膜上的不饱和脂肪酸，触发链式过氧化反应产生脂质过氧化物(丙二醛和4羟基壬醇)[4]。

　　中医认为该病发生机理以气滞血瘀为本，以肝胆湿热为标；以饮食不节、情志不调、肝失疏泄为诱因；以气滞于内、肝络阻塞，脾失健运、湿浊内生，气血痰瘀互结于胁下为基本病机。山慈菇药材收载于中国药典2005版[5]，植物来源有兰科植物杜鹃兰cremastra appendiculata(D. Don)makino、独蒜兰pleione bulbocodioides(Franch.)rolfe和云南独蒜兰pleione yunnanensis rolfe三种，药用部位为干燥假鳞茎，杜鹃兰是主要品种。山慈菇有清热解毒、化痰散结、消肿止痛的功效。其所含秋水仙碱能抑制粒细胞浸润和乳酸的生成，有抗炎、止痛作用。慈菇消脂丸是以山慈菇为君药的中药复方，方中山慈菇作为君药，有化痰解毒、消脂散结之功；泽泻、山楂以祛脂化浊；丹参、土鳖虫以逐瘀通络；柴胡、黄芩、法半夏以疏肝理脾；决明子清肝降脂；整体组方立法解毒化痰、消降浊脂。本文拟通过动物实验探讨慈菇消脂丸对非酒精性脂肪性肝炎的防治作用及其机制。
　　
　　COX2基因定位于1号染色体，长度为8kb，含10个外显子和9个内含子，是迅速短暂的早期即刻基因，呈诱导型表达，即正常生理状态下多数组织不表达[6]，当受到包括生长因子、细胞因子、炎症介质、细菌内毒素和激素等刺激因素作用时，其表达迅速上调[7]。COX2及其代谢产物PG参与炎症反应、细胞增殖、抑制凋亡等病理生理过程。NASH时，体内的内毒素脂多糖(LPS)、活性氧(ROS)和细胞因子如TNFα、IL1、IL6等增多，而这些因子均可激活NFκB使其移位进入细胞核，参与COX2的高表达。曹名波等[8]通过动物实验证实大鼠非酒精性脂肪性肝炎COX2的表达明显增强，且与肝脏炎症呈正相关。iNOS为诱导型一氧化氮合酶，在正常情况下，肝组织中无或仅有较少iNOS表达。在内毒素、脂多糖(LPS)和致炎因子等的作用下，肝细胞、肝巨噬细胞、中性粒细胞等的iNOS产生迅速上调[9]，这些刺激因素通常协同作用诱导iNOS的表达，其产生的大量NO参与诸多病理过程。洪捷敏等[10]通过动物实验证实乙醇诱导脂肪肝过程中肝组织NO水平升高主要与iNOS的活化有关，iNOS产生的NO可能与脂质过氧化损伤有关。
　　
　　本文研究结果表明，在大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝组织内，SOD活性显著降低，而MDA含量显著增加，肝内氧化抗氧化系统平衡失调，氧化损伤为其主要发病机制。同时炎症介质COX2、iNOS蛋白表达亦显著增加。慈菇消脂丸治疗组则大鼠肝组织脂肪变性明显减轻，肝内SOD活性显著提高，而MDA含量显著降低，炎症介质COX2、iNOS蛋白表达亦显著降低。且上述药理作用均较阳性对照药物显著。实验结果说明慈菇消脂丸具有防治脂肪肝的作用，其机制主要为减轻肝细胞脂肪变性、抗脂质过氧化损伤及抗炎。

参考文献

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　　[3]ZHANG Q， ZHAO Y， ZHANG DB， et al. Effect of Sinai San decoction on the development of nonalcoholic steatohepatitis in rats [J]. World J Gastroenterology， 2005， 11(9):13921395.

　　[4]范建高. 重视非酒精性脂肪性肝病发病机制的研究 [J]. 国外医学·消化系疾病分册， 2003， 23(6):323326.

　　[5]国家药典编委会. Ch P(中国药典) [S]. 北京:化学工业出版社， 2005.

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　　[7]ENOMOTO N， IKEJIMA K， YAMASHINA S， et al. Kupffer cell derived prostaglandin E(2) is involved in alcoholic induced fat accumulation in rat liver [J]. Am J Physio Gastrointest Liver Physio， 2000， 279(1):G100G106.

　　[8]曹名波，董雷，鲁晓岚，等. 环氧合酶2在非酒精性脂肪肝病中的表达及意义 [J]. 第四军医大学学报， 2008， 29(14):12821285.

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　　[10]洪捷敏，田德安，刘南植，等. 乙醇诱导脂肪肝过程中肝组织一氧化氮合酶的表达及作用 [J]. 中华消化杂志， 2004， 24(8):468471.