甘精胰岛素对糖尿病大鼠心肌纤维化及超微结构的影响

　　　　　　 作者：金秀平，吴云丹，崔路坤

【摘要】 目的 探讨甘精胰岛素对糖尿病大鼠心肌的保护作用。方法 将雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病组(DM组)和胰岛素治疗组(DI组)，DI组给予甘精胰岛素经腹部皮下注射，治疗5周后称重并计算心脏体重比(H/B)；免疫组化法测定各组心肌转化生长因子β1(TGFβ1)、Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)的表达；透射电镜观察心肌超微结构。结果 ①与NC组比较，DM组和DI组的H/B、TGFβ1、collagen Ⅲ均明显增高(P<0.05)；与DM组比较，DI组的H/B、TGF β1、collagen Ⅲ均下降(P<0.05)。②心肌超微结构：DM组肌原纤维排列紊乱，线粒体增多，常有肿胀变性；而DI组病变轻微。结论 甘精胰岛素降低了心肌组织中TGFβ1及collagen Ⅲ的表达，延缓了糖尿病大鼠心肌纤维化的进程，改善了心肌超微结构。

【关键词】 甘精胰岛素；转化生长因子β1；Ⅲ型胶原蛋白；心肌超微结构；糖尿病

　　ABSTRACT: Objective To investigate the protective effect of insulin glargine in myocardium of diabetic rats. Methods Male Wistar rats were randomly pided into normal control group (NC)， diabetes mellitus group (DM)， diabetes with insulin glargine [1.5U/(kg·d)] treatment group (DI). After 6 weeks， we weighed rats and calculated the heart body weight ratio (H/B)， Immunohistochemical technique was used to estimate the expression of transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) and the typeⅢ collagen (collagen Ⅲ). Myocardial pathologic changes were observed under transmission electronic microscope. Results ① The levels of H/B and the expression of TGFβ1 and collagen Ⅲ of DM group and DI group were significantly higher than those in NC group (P<0.05); the levels of H/B and the expression of TGFβ1 and collagen Ⅲ of DI group were lower than those in DM group (P<0.05). ② Myocardial ultrastructure: In DM group， myofibrils were arranged disorderly， mitochondria increased， with swelling and degeneration， while the changes of myocardial ultrastructure were obviously lightened after treatment with insulin glargine. Conclusion Insulin glargine may partly suppress the increased expression of TGFβ1 and collagen Ⅲ in myocardial of diabetic rats， and it may decrease significantly the myocardial injury of diabetic rats.

　　KEY WORDS: insulin glargine; transforming growth factor beta 1 (TGFβ1); collagen Ⅲ; ultrastructure of myocardium; diabetes

　　糖尿病心肌病是糖尿病的心血管并发症之一，其发病与心肌细胞结构异常、心肌细胞外基质增生及糖、脂代谢紊乱有关[12]。DCCT临床研究证实，早期应用胰岛素强化治疗可显著减少糖尿病的慢性并发症，尤其是微血管并发症的发生[3]。本研究通过应用甘精胰岛素治疗糖尿病大鼠，观察治疗前、后心肌组织中转化生长因子β1(transforming growth factor beta1， TGFβ1)及III型胶原蛋白(collagen III)表达的变化及心肌超微结构的改变，探讨甘精胰岛素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　雄性健康Wistar大鼠35只，2月龄，体重180～220g，由北京维通利华实验动物中心提供。

　　1.2 主要试剂及仪器

　　链脲佐菌素(Sigma公司)；甘精胰岛素(北京甘李药业)；免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物公司；末梢全血血糖仪及试纸(美国强生公司)；透射电镜(日本日立H7650型)。

　　1.3 方法

　　1.1.1 动物模型的建立和分组

　　35只大鼠随机分为正常对照组(NC组，10只)和造模组(25只)。造模组大鼠禁食12h后腹腔注射链脲佐菌素65mg/kg，1周后尾静脉采血测血糖，以随机血糖≥16.7mmol/L作为糖尿病模型的判断标准。将造模成功的23只大鼠随机分为糖尿病组(DM组，13只)和胰岛素治疗组(DI组，10只)。两组大鼠血糖、体重无明显差异，具有可比性。DM组不给予治疗；DI组给予甘精胰岛素腹部皮下注射，并监测血糖，调整胰岛素用量，使大鼠血糖控制在7～8mmol/L左右，甘精胰岛素用量约为1.5U/(kg·d)，治疗5周。

　　1.3.2 标本制备

　　第6周末经尾静脉采血测血糖。大鼠称重后100g/L水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉，取血检测血清甘油三酯(triglyceride， TG)、总胆固醇(total cholesterol， TC)、低密度脂蛋白(low density lipoproteincholesterol， LDLC)、高密度脂蛋白(high density lipoproteincholesterol， HDLC)。经胸腔迅速取出心脏，冰盐水冲洗，剪除心包膜、血管，用滤纸吸干后称重，计算心脏体重比(H/B)。取左室心肌组织置于40g/L戊二醛磷酸盐缓冲液中固定，切成1mm3 组织块，制成超薄切片置透射电镜下观察。

　　1.3.3 TGFβ1、collagenⅢ的检测

　　心肌切片常规脱蜡水化，酶抗原修复，滴加1∶100稀释的兔抗鼠TGFβ1、collagenⅢ多克隆抗体，4℃冰箱过夜，DAB显色，光镜下观察。在400倍光镜下，每张切片随机检测5个视野，计算平均积分吸光度(A)，以每组A值进行统计学分析。

　　1.4 统计学处理

　　实验数据均符合正态分布，方差齐，以±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析和q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 造模情况

　　2只大鼠造模未成功，从实验中剔除，实验期间DM组2只大鼠死亡，共31只大鼠进入实验终点。

　　2.2 血生化指标结果

　　与NC组相比，DM组血糖、H/B、TC、TG、LDLC明显升高，HDLC明显降低(P<0.05)。与DM组相比，DI组血糖、H/B、TC、TG、LDLC明显降低、HDLC明显升高(P<0.05)。与NC组相比，DI组H/B、TC、TG升高(P<0.05)，血糖、LDLC、HDLC差异无统计学意义(P>0.05，表1)。表1 第6周末三组H/B、血糖、血脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的变化（略）

　　2.3 免疫组化及图像分析半定量的结果

　　TGFβ1阳性表达呈棕黄色，位于胞质内。NC组心肌细胞胞质内可见少许阳性物质；DM组心肌细胞胞质内或血管周围可见阳性物质明显增多；DI组心肌细胞胞质内阳性物质较DM组明显减少。CollagenⅢ 阳性表达呈棕黄色，位于心肌细胞周围或小血管周围。NC组心肌细胞周围可见少许阳性物质；DM组心肌细胞周围或小血管周围可见大量阳性物质；DI组心肌细胞周围阳性物质较DM组明显减少。DM组TGFβ1 及collagenⅢ A值均明显高于NC组(P<0.05)。DI组TGFβ1及CollagenⅢ A值均低于DM组、高于NC组(P<0.05，表2，图1、图2)。表2 三组大鼠心肌细胞TGFβ1 和collagenⅢ表达的比较（略）

　　2.4 透射电镜的结果

　　NC组心肌细胞内肌丝、肌节结构清晰，排列整齐，线粒体排列整齐，线粒体内嵴结构清晰，排列密集。DM组心肌细胞内肌节结构紊乱，肌丝排列稀疏、灶性溶解，甚至片状坏死;线粒体变性、肿胀，甚至空泡样变，线粒体内嵴结构紊乱、排列稀疏、甚至消失。DI组与DM组相比肌丝、肌节结构明显整齐，线粒体排列及内嵴结构明显规整，线粒体肿胀、空泡变性明显减少(图3)。

　　3 讨 论

　　糖尿病心肌病的发病机制尚未完全明了。近年来研究发现，TGFβ1在糖尿病心肌病变中起着重要作用：一方面，它可影响细胞周期表达，促进细胞肥大；另一方面，它可在各种内、外源性刺激下使心肌成纤维细胞合成胶原蛋白、纤维连接蛋白增多。胶原蛋白如collagenⅢ是细胞外基质(extracellular matrix， ECM)中的主要成分[4]，激活的TGFβ1可抑制蛋白水解酶的表达，从而减少ECM的降解，使胶原大量沉积，导致或加速组织纤维化的发生，增加了心室壁的僵硬度，降低了心室顺应性，使心室收缩及舒张功能不全，最终出现心力衰竭[5]。本研究结果显示，糖尿病大鼠H/B明显增高，心肌组织中TGFβ1表达明显升高，collagenⅢ的表达也增加。说明长期的糖、脂代谢紊乱可促进TGFβ1及collagenⅢ的合成。透射电镜下可见糖尿病组大鼠心肌细胞线粒体肿胀，嵴断裂、溶解，肌原纤维排列紊乱、溶解，甚至大片坏死，心肌间质纤维增多，进一步证明糖尿病大鼠存在明显的心肌能量代谢障碍和心肌纤维化，这将影响心肌细胞的收缩和舒张功能。

　　 本研究结果还显示，糖尿病大鼠给予甘精胰岛素治疗后，大鼠糖、脂代谢紊乱明显好转，H/B下降，TGFβ1及collagenⅢ的表达也较糖尿病组明显降低，且电镜下可见肌原纤维排列明显整齐，线粒体排列及内嵴结构明显规整，仅有少量线粒体肿胀。说明甘精胰岛素可降低心肌组织中TGFβ1及collagenⅢ的表达，减轻心肌损伤。体外实验也显示高糖可刺激乳鼠心肌细胞分泌TGFβ1增加，给予适量胰岛素后可降低TGFβ1的表达[6]。

　　综上所述，甘精胰岛素能明显抑制心肌超微结构的改变，延缓或抑制糖尿病心肌纤维化的发生、发展，其保护作用可能与胰岛素通过降低心肌组织中TGFβ1及collagenⅢ的表达有关。

参考文献

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