放射抗拒性鼻咽癌细胞系的建立及差异表达基因

　　　　 作者：王亚利，王西京，王中卫，金迎迎，李毅

【摘要】 目的 筛选同一来源放射敏感性不同鼻咽癌细胞基因差异表达，探讨鼻咽癌放射抗拒机理。方法 用X射线间歇多次照射鼻咽癌细胞株CNE2建立放射抗拒性细胞CNE2R，采用BioStarH141s型基因芯片检测CNE2与CNE2R差异表达基因。结果 CNE2和CNE2R细胞有差异表达的基因308条，上调176个，下调132个。在差异表达的基因中，有76个位点出现6倍以上的差异，其中36个下调、40个上调，包括与DNA修复相关、细胞周期、凋亡、细胞骨架相关蛋白、细胞增殖、代谢、蛋白质合成、信号转导、免疫相关等方面相关的基因，基因分布变化较明显的主要是DNA修复相关基因、细胞骨架、细胞周期和凋亡相关基因。结论 CNE2细胞反复照射后产生放射抗拒性细胞，在基因水平上发生了某些突变，通过调控其中相关基因，就有可能调控细胞的放射敏感性。

【关键词】 鼻咽癌；基因芯片；放射抗拒性

　　ABSTRACT: Objective To observe the differential gene expression in human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line with different radiosensitivity by cDNA microarray analysis. Methods A radioresistant cell line， CNE2R， was established from a human nasopharyngeal carcinoma cells line CNE2 by repeated Xray irradiation. The differential gene expression of CNE2 and CNE2R was screened with cDNA microarray by BioStarH141s profile gene chip. Results There were expressed 308 genes to be screened out between CNE2R cell line with different radiosensitivity and its parental CNE2 cell line， while 176 upregulated genes in CNE2R cells and 132 downregulated genes were found. In them， there were 40 upregulated ones and 36 downregulated ones whose ratios were higher than 6.0 or lower than 0.1. The different genes included DNA damage and repairrelated genes; cell cyclerelated and cytoskeletonrelated proteins; and apoptosisrelated genes. Conclusion The radioresistant CNE2R cells were isolated from the CNE2 cell line by repeated Xray irradiation. The stable radioresistance is the result of coeffect by polygene and multiple factors， which provide several gene targets to sensitize the radioresistant cells for improving the radiocurability of NPC.

　　KEY WORDS: nasopharyngeal carcinoma; cDNA microarray; radioresistance

　　放射治疗是鼻咽癌治疗最主要的手段，射线杀死了相对敏感的鼻咽癌细胞，而相对抵抗的亚细胞系则存活并增殖，成为复发的根源。近几年来，鼻咽癌的放射治疗的技术如调强放疗(intensity modulated radiation therapy， IMRT)，图像引导的调强放疗(image guided radiation therapy， IGRT)等取得了巨大的进展，但是如何克服放射抵抗性尚无理想途径。我们前期利用射线反复照射鼻咽鳞癌细胞株CNE2筛选出在形态学及放射生物学参数稳定的放射抗拒鼻咽癌细胞系CNE2R[1]。在此基础上对两株细胞进行2Gy照射后利用基因芯片分析二者差异表达的基因，以期发现与放射敏感性的相关基因，进一步建立鼻咽癌辐射相关基因芯片，为探讨鼻咽癌放射抗拒机理提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养

　　CNE2及CNE2R置于含100mL/L小牛血清、30g/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液内，在37℃饱和湿度的培养箱内培养。

　　1.2 集落形成实验

　　指数生长期细胞用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA消化计数后制备单细胞悬液，接种于6孔板(2mL/孔)，每种细胞设6个复孔。根据不同细胞数目给予不同的照射剂量，细胞数2.0×102、2.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106贴壁12h后分别接受6MVX射线单次剂量照射0、2、4、6、8、10Gy，将培养皿移入培养箱内，静止培养至6孔板出现肉眼可见的克隆(14～20d)。甲醇固定、Giemsa染色、低倍镜下计数所形成的集落数(≥50个细胞数的集落为有效的集落)。按照下述公式计算克隆形成率(plating efficiency， PE)=形成克隆数/种植细胞数×100%；存活分数(survival fraction， SF)=实验组克隆形成率/对照组克隆形成率×PE。绘制剂量-存活曲线，计算照射2Gy后细胞存活分数(SF2)。

　　1.3 照射方法

　　Varian 2300C/D直线加速器6MVX射线照射，源皮距100cm，剂量率2Gy/min。表面覆1cm厚组织补偿胶。取指数生长的CNE2及CNE2R细胞，2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA消化成单细胞悬液种植于25cm2培养瓶中，种植细胞密度为1.0×106/cm2，贴壁后6MVX射线照射2Gy，置于培养箱中继续常规培养24h用于后续研究。

　　1.4 基因芯片

　　由上海博星基因芯片有限公司提供，型号为BioStarH141s。该芯片含有14112点的人类全长基因cDNA表达谱芯片，几乎涵盖了人类基因组的全部功能基因。分32阵，每阵由21×21个点组成，点样面积为18mm×36mm。阳性对照(包括管家基因)96个位点，阴性对照16点，内参基因20点，空白对照41点。

　　1.5 基因芯片分析

　　取照射后24h的CNE2及CNE2R细胞，用1mL Trizol(GIBCO公司)分别提取CNE2及CNE2R细胞的总RNA，用Qiagen公司的OligotexmRNAmidiKit从总RNA中分离poly+(A)mRNA，将所提取的mRNA进行逆转录，并用Cy5dCTP、Cy3dCTP标记两种cDNA。与BiostarH140s型芯片进行杂交并扫描，利用GenePixPro4.0图像分析软件处理数据判断基因是否在两个细胞中存在差异表达。

　　1.5.1 表达谱芯片的制备

　　用载体两端通用引物对全长基因进行PCR扩增，产物长度为1000～3000bp，琼脂糖电泳监控PCR质量。浓缩后的扩增产物作为靶基因溶解于点样液中，用CartesianPixsys 7500点样仪点在硅烷化玻片上。点样后玻片进行2h水合、室温干燥30min，2g/L SDS、h3O及2g/L硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。

　　1.5.2 探针制备

　　一步法抽提CNE2与CNE2R细胞总RNA，将RNA沉淀溶解在RNasefree的MilliQ水中，测D(260)/D(280)，D(260)/D(230)。按Qiagen公司OligotexmRNAspincolumn操作进行RNA纯化。在50μL逆转录反应体系中加入3μg mRNA，逆转录合成及纯化cDNA探针，用Cy3dUTP标记CNE2细胞mRNA，用Cy5dUTP标记CNE2R细胞mRNA。乙醇沉淀后将Cy3dUTP和Cy5dUTP标记的探针混合溶解在20μL 5×SSC+2g/L SDS杂交液中。

　　1.5.3 杂交和洗涤

　　将表达谱芯片和杂交探针分别做95℃变性30s和2min后置于杂交舱内，将探针加在基因芯片上。于恒温杂交箱内42℃杂交18h。按顺序用2×SSC+2g/L SDS、SSC+2g/L SDS、SSC洗涤10min，室温晾干。

　　1.5.4 生物学信息分析

　　ScanArray4000扫描仪扫描芯片，得到的Cy3/Cy5图像文件通过划格确定杂交点范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光信号强度值。实验数据进行均一化处理，依据以下2个原则筛选出参与均一化处理的有效基因点：①该基因点的Cy3、Cy5信号值皆大于200，或者其中之一大于800；②该基因点的Cy5信号值/Cy3信号值的比值在0.1～10之间。用GenePixPro4.0图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，筛选出比值大于2或小于0.5的基因点。

　　2 结 果

　　2.1 细胞集落形成

　　人鼻咽癌细胞系CNE2及CNE2R照射后的克隆存活分析提示CNE2与CNE2R细胞经X线照射后呈指数性杀灭，同一剂量照射后CNE2R细胞SF值更高(图1)；CNE2及CNE2R细胞SF2分别为0.21和0.57，就SF2而言CNE2R细胞的放射抗性是其亲本细胞CNE2的2.71倍。

　　2.2 总RNA提取结果

　　CNE2、CNE2R细胞株平均D260/280值为1.89，电泳可见清析28S、18S条带，电泳结果证实高纯化的RNA无降解(图2)。

　　2.3 差异表达基因筛选结果

　　CNE2和CNE2R细胞有差异表达的基因308条，在差异表达的基因中，上调176个，下调132个(图3)。有40个位点出现6倍以上的差异，36个位点出现0.1以下差异。包括与DNA修复相关、细胞周期、凋亡、细胞骨架相关蛋白、细胞增殖、代谢、蛋白质合成、信号转导、免疫相关等方面相关的基因，基因分布变化较明显的主要是DNA修复相关基因、细胞骨架、细胞周期和凋亡相关基因(表1)。表1 CNE2R细胞中差异表达的基因(略)

　　3 讨 论

　　本课题所选基因表达芯片含有DNA合成、修复、信号转导、蛋白翻译合成以及细胞骨架运动、离子通道、细胞代谢、癌基因、细胞周期、转录因子等相关的14112条cDNA，共检出308个基因位点在CNE2和CNE2R之间存在差异表达，说明鼻咽癌辐射敏感性是多基因参与表达改变的结果，肿瘤放射敏感性与多种因素相关。在差异表达的基因中，与DNA修复、细胞骨架、细胞周期和凋亡相关基因分布较为明显。我们认为CNE2细胞受射线反复照射，在基因水平上发生了某些突变，并将这些突变稳定的遗传下来，通过调控其中与放射抗拒性产生相关的某些基因，就有可能调控细胞的放射敏感性[2]。
　　
　　放射生物学研究表明，放射线作用的靶主要是肿瘤细胞DNA，导致DNA双链或单链断裂，影响肿瘤细胞复制导致死亡[3]。本研究筛选的差异表达的基因中与DNA修复相关最多。目前已发现130多个DNA修复相关基因，在不同DNA损伤修复方式中相互协作[4]。ERCC1在核苷酸切除修复途径修复过程中发挥重要作用，与XPF/ERCC4形成异源二聚体，具有5′核酸内切酶活性，参与DNA链的切割和损伤识别。DNA依赖性蛋白激酶(DNAdepended protein kinase， DNAPK)是DNA损伤修复的关键酶，决定着受损肿瘤细胞的转归。DNAPKcs参与多种生化反应过程: DNA断裂双链的修复、程序性死亡的信号传导、基因监视、端粒结构的维持等[5]。本研究发现，ERCC1、DNAPKcs、TOP2A、GADD45A、POLA1、RFC2、RAD1、PRKDC等表达在放射抗拒CNE2R细胞中均处于上调，提示放射线作用于CNE2细胞后DNA修复机制功能受到抑制，受损DNA不能得到及时修复从而引起细胞凋亡、死亡，而CNE2R的DNA修复功能未受到抑制，甚至某些方面增强，从而表现出对射线耐受的特性。此外一些参与细胞增殖的基因，如MDM2、Bcl2、PKCz和PIM2在照射后CNE2R细胞中表达水平明显增加，提示这些基因可能参与了CNE2R细胞辐射抗性的形成，是细胞致敏的潜在靶点。
　　
　　细胞周期阻滞是放射引起的重要生物学改变之一[6]。研究证实，电离辐射所致的DNA损伤可被细胞内特定的感受器如ATM(ATR)蛋白、DNAPK所感知，并通过多个基因及分子参与的信号传导网络传递到细胞周期节点，引发检查点调控因子反应，导致相应周期时相阻滞[7]。我们发现，CNE2R细胞中CCNB1、CCNB2、CCNE1、CUL5基因表达上调，而CCNA、CDKN1A、CDK2、CHEK1基因下调。认为CCNE1、CUL5、 CDKN1A、CDKN1C基因极有可能参与了放疗中肿瘤细胞加速再增殖的调控过程。这些基因参与肿瘤细胞加速增殖的可能机理是照射过程中参与调节细胞周期，延迟细胞进入S期从而抑制细胞周期的进程，以利于有充分的修复时间，导致细胞放射抗拒。
　　
　　细胞骨架在维持细胞形态、运动、基因表达、信息传递以及能量转换等方面有重要作用[8]。ACTN1是一种丰富的交叉连接肌动蛋白的细胞骨架蛋白。在维持细胞形态、参与细胞黏附和迁移以及在细胞增殖和分化的信号转导过程中发挥调节功能。Ezrin广泛分布在包含肌动蛋白的细胞微绒毛与微皱襞中，通过氨基端与细胞膜相连，羧基端与细胞骨架相连成为膜细胞骨架的连接子[9]。细胞角蛋白作为细胞骨架中间丝的成分，与维持细胞形态、运动等基本功能密切相关。E钙黏素局限于组织的上皮细胞，是上皮细胞间黏着连接的关键成分，参与调节组织发生和形态分化，对细胞识别、迁移、归类等行为及细胞命运发挥重要作用[10]。我们发现，CNE2R细胞骨架相关蛋白相关基因ACTN1、CDH1、ACTB、S100a13、EZR等基因表达上调，KRT13、ANXA5、S100a6、CTTN、Xbp1、DCN等基因表达下调。我们认为，放射线改变了细胞形态，影响细胞的信息传递，从而改变肿瘤细胞的稳定性，改变了细胞的放射敏感性。
　　
　　凋亡是辐射诱导肿瘤细胞死亡的另一个重要机制[11]。我们发现，CNE2R细胞中Apaf1、FADD、CASP9、TRADD、NFKBIA、MOAP1、DR5基因表达上调，EIB、GZMB、CAS3、MAPK8、JNK3基因表达下调。我们认为，放射线能选择性地激活有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)传导通路和cJUN N末端激酶3(JNK3)，从而诱发肿瘤细胞的细胞凋亡作用。JNK是有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)家族的成员之一，被激活后能转移到核内调控cjun、ATF2等转录因子的表达而诱导细胞凋亡。本研究进一步表明，放射线激活肿瘤细胞的JNK3信号通路主要是通过上调该信号通路的相关活化蛋白基因的表达和下调相关抑制蛋白基因的表达而间接实现的[12]。Bcl2能抑制线粒体细胞色素C的释放，从而阻止Caspase信号途径的活化，抑制凋亡[13]。
　　
　　此外，本研究发现了3个新的放射敏感性相关基因RASSF1A、PSME3和UBAP1。RASSF1A基因是最近新研究的位于3p21.3上的鼻咽癌候选抑瘤基因之一，属于RAS区域相关家族基因。RASSF1A基因表达失活在鼻咽癌中经常发生，可能由基因的突变或缺失引起，也可能由于高甲基化等表观遗传改变引起，但目前尚未有其与鼻咽癌辐射敏感性的相关报道[14]。综上所述，我们用高通量基因表达谱芯片分析了同源但放射敏感性不同鼻咽癌细胞照射后基因表达情况。初步证实鼻咽癌辐射敏感性是多基因参与表达改变的结果，肿瘤放射敏感性与多种因素相关。今后我们将建立鼻咽癌辐射敏感性相关基因芯片，进一步用蛋白质芯片、RNA干扰、蛋白互作等技术探讨鼻咽癌放射抗拒的机理。

参考文献

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